small GTPase, GTPase activating protein (GAP), phagocyte, NADPH oxidase, Rac, Rho, prenylation
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Participants
Hably, Csilla Lévay, Magdolna Orient, Anna Rada, Balázs Sirokmány, Gábor Timár, Csaba István
Starting date
2006-02-01
Closing date
2009-08-31
Funding (in million HUF)
32.500
FTE (full time equivalent)
9.10
state
closed project
Summary in Hungarian
GTPáz aktiváló proteinek (GAPok) serkentik a monomer G-fehérjék GTP hidrolizisét, és ezzel lerövidítik a G-fehérje által szabályozott jelátviteli lépés időtartamát. Különböző kísérleti rendszerekben nyert eredmények arra utalnak, hogy számos sejtélettani folyamatot állandó GAP-szabályozás tart féken, amelynek kiesése súlyos következményekkel jár, mint pl. tumor keletkezés, vagy a szövetek agresszív oxidatív károsítása. A Rho/Rac fehérjéken GAP-hatást kifejtő proteinek száma többszörösen meghaladja a szabályozott G-fehérjék számát, alig vannak azonban ismereteink az egyes GAP-ok specifikus sejtélettani szerepéről, sejten belüli interakcióikról, lehetséges szabályozásukról. Ez a kutatási terv néhány RhoGAP élettani szerepének és szabályozásának vizsgálatát tűzi ki célul sejtmentes rendszerekben, izolált és tenyésztett sejten, valamint genetikailag módosított állatokból kinyert sejteken végzett kísérletek alapján. Kezdetben a p50GAP és a p190GAP molekulákra koncentrálunk, amelyekről a közelmúltban lényeges új információkat tettünk közzé. Megvizsgáljuk szerepüket a fagocita NADPH oxidáz szabályozásában, a fagociták baktériumölő működésében, valamint az intracelluláris membrán körforgásban. A továbbiakban pedig egy leukocitákra specifikus, eddig nem expresszált GAP molekulára, valamint egy baktériumok által az emlős sejtekbe injektált GAP-hatású toxinra koncentrálunk. A kutatási támogatás 3 új PhD hallgató kísérleti munkáját biztosítja.
Summary
GTPase activating proteins (GAPs) accelerate the hydrolysis of GTP by small GTPases, thereby down-regulating and limiting in time the effect of the relevant GTPase. Data obtained in different experimental systems indicate that several cell physiological processes are under constant GAP-control. Lack of this down-regulating effect may result in severe alterations such as tumour development or agressive oxidative damage. The number of GAPs acting on Rho family GTPases largely exceeds the number of regulated GTPases, but at the moment information is lacking on the specific action, intracellular interactions and regulation of various GAPs. The aim of the presented proposal is to investigate the physiological role and regulation of some Rho/RacGAPs in cell-free systems, isolated and cultured cells and on cells of genetically modified animals. First we shall focus on p50GAP and p190GAP about which we have recently published original, important informations. We shall investigate their role in the regulation of phagocytic NADPH oxidase, of bacterial killing activity of phagocytes and intracellular membrane traffic. Later we shall concentrate on a hitherto not expressed GAP that is supposed to be specific for peripheral blood leukocytes, and on the effects of a bacterial toxin with RhoGAP activity on granulocyte function. We shall investigate the role of the prenyl moiety of GTPases in protein-protein interactions. This project allows the training of 3 PhD students.
Final report
Results in Hungarian
Kísérleteinkben három, a Rho/Rac családba tartozó kis G-fehérjére ható GTPáz aktiváló fehérje (GAP) élettani szerepét vizsgáltuk 1.) A p50GAP-ról megállapítottuk, hogy jellegzetes, magkörüli elhelyezkedést mutat. Transzferrin- valamint EGF-receptorokkal végzett kolokalizációs vizsgálatok alapján azonosítottuk, hogy a p50GAP Sec-14 doménje felelős a Rab11-et tartalmazó késői endoszómákon történő lokalizációért valamint a transzferrin-felvétel gátlásáért. Először írtunk le kapcsolatot a Rho valamint a Rab családba tartozó kis G-fehérjék között a receptor-mediált endocitózis szabályozásában. 2.) A p190GAP fehérje GAP aktivitásában kimutattuk két különböző kináz által bekövetkező foszforiláció eltérő hatását. A GSK-3 foszforiláció egyaránt gátolja a p190 Rho- és RacGAP aktivitását. Ezzel szemben a PKC-foszforiláció önmagában nem befolyásolja a GAP-aktivitást, viszont hatásosan gátolja a savanyú foszfolipidekhez történő kötődést. A savanyú foszfolipidek egyedülálló módon megváltoztatják az enzim szubsztrát-specificitását: csökkentik a RhoGAP aktivitást és növelik a RacGAP aktivitást. 3.) Felfedeztünk egy eddig ismeretlen GAP-ot, ami in vitro körülmények között Rac-specifikusnak bizonyult és elsősorban hemopoetikus sejtekben fejeződik ki. siRNS-el történt csendesítése növelte PLB sejtekben az opszonizált részecskék fagocitózisát valamint az általuk kiváltott szuperoxid-termelést, viszont nem befolyásolta a PMA-val indukált választ.
Results in English
Our experiments concentrated on the physiological role of three GTPase activating proteins (GAPs) acting on Rho/Rac family small GTPases. 1.) p50GAP showed a characteristic, perinuclear localization. On the basis of colocalization with transferrin- and EGF-receptors we demonstrated that the Sec14 domain of p50GAP was responsible both for localization on Rab11-containing late endosomes and for inhibition of transferrin uptake. We suggested that p50GAP provides a link between Rab and Rho family small GTPases in the regulation of receptor-mediated endocytosis. 2.) Investigating the regulation of p190GAP, we revealed the different effects of phosphorylation by different kinases. Phosphorylation by GSK-3 inhibits both the Rho- and the RacGAP activity of the protein. In contrast, phosphorylation by PKC does not directly affect the GAP activity, but it prevents binding of p190GAP to acidic phospholipids, which have a unique effect: they change the substrate preference of p190GAP inhibiting the RhoGAP and promoting the RacGAP activity. 3.) We revealed a new, hitherto unknown GAP that proved to be Rac-specific in in vitro assays, and seems to be specifically expressed in haemopoetic cells. Silencing of this new GAP in PLB cells resulted in an increase of phagocytosis of opsonized particles and of superoxide production induced by opsonized zymosan or bacteria. In contrast, responses induced by PMA were not altered.
Sirokmány G., Szidonya L., Káldi K. Gáborik Zs., Ligeti E., Geiszt M.: Sec14 homology domain targets p50RhoGAP to endosomes and provides a link between Rab- and Rho GTPases, Journal of Biological Chemistry, 281. 6096-6105., 2006
Femling JK, Cherny VV, Morgan D, Rada B, Davis AP, Czirjak G, Enyedi P, England SK, Moreland JG, Ligeti E, Nauseef WM, DeCoursey TE.: The antibacterial activity of human neutrophils and eosinophils requires proton channels but not BK channels, Journal of General Physiology 127. 659-672., 2006
Ligeti E, Settleman J.: Regulation of RhoGAP specificity by phospholipids and prenylation, Methods in Enzymology 406. 104-417., 2006
Sirokmány Gábor: A p50 Rho GTPáz aktiváló fehérje fehérjedoménjeinek jelátviteli szerepe a sejtek membránforgalmában, SE Doktori Iskola, PhD értekezés, 2006
Rada B, Hably C, Meczner A, Timár C, Lakatos G, Enyedi P, Ligeti E.: Role of Nox2 in elimination of microorganisms, Semin Immunopathol. 30. 237-53., 2008
Jiang W, Betson M, Mulloy R, Foster R, Lévay M, Ligeti E, Settleman J.: p190A RhoGAP is a glycogen synthase kinase-3-{beta} substrate required for polarized cell migration., Journal of Biological Chemistry, 283. 20978-20988., 2008
Blüml S, Rosc B, Lorincz A, Seyerl M, Kirchberger S, Oskolkova O, Bochkov VN, Majdic O, Ligeti E, Stöckl J.: The oxidation state of phospholipids controls the oxidative burst in neutrophil granulocytes, Journal of Immunology, 181. 4347-4353., 2008
Lévay M, Settleman J, Ligeti E.: Regulation of the Substrate Preference of p190RhoGAP by Protein Kinase C-Mediated Phosphorylation of a Phospholipid Binding Site., Biochemistry. 48. 8615-23., 2009
Csépányi Kömi R., Lázár E., Sirokmány G., Geiszt M., Ligeti E.: Az ARHGAP25 a Rac kis G fehérjén keresztül szabályozza a neutrofil granulociták fagocita funkcióját, Magyar Élettani Társaság Vándorgyűlése IM/85, 2009
Csépányi-Kömi Roland, Lázár Enikő, Sirokmány Gábor, Geiszt Miklós, Ligeti Erzsébet: Az ARHGAP25 a neutrofil granulociták fagocitózisának egyik lehetséges szabályozója, PhD Tudományos Napok, Semmelweis Egyetem, P-IV/3, 2009
