The structure and conformation dependent activity of VWF and its implications on vascular haematology  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
62317
Type K
Principal investigator Hársfalvi, Jolán
Title in Hungarian A Von Willebrand Faktor multimer- és konformáció függő aktivitása és a vascularis haematologia
Title in English The structure and conformation dependent activity of VWF and its implications on vascular haematology
Keywords in Hungarian VWF, haemorheologia, multimer szerkezet, protein konformáció,thrombocyta, GPIb, kollagén
Keywords in English VWF, haemorheology, multimeric structure, protein conformation, platelets, GPIb, collagen
Discipline
Cardiovascular system (Council of Medical and Biological Sciences)80 %
Haematology, immunology, thrombosis, infectious diseases (Council of Medical and Biological Sciences)10 %
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)10 %
Panel Physiology, Pathophysiology, Pharmacology and Endocrinology
Department or equivalent Department of Laboratory Medicine, Division of Clinical Laboratory Science (University of Debrecen)
Participants Budainé Dr. Tóth, Judit
Elek, Norbert
Fazakas, Ferenc
Kellermayer, Miklós Sándor Zoltán
Mendelboum, Shlomit
Nagy, Béla
Schlammadinger, Ágota
Szabó, István
Szántó, Tímea
Tornai, István
Udvardy, Miklós László
Starting date 2006-02-01
Closing date 2010-01-31
Funding (in million HUF) 17.041
FTE (full time equivalent) 7.03
state closed project
Summary in Hungarian
A von Willebrand faktor (VWF) 500-20000 kDa molekulatömegű plazma és thrombocyta glikoprotein. Nagy nyíróerő hatása alatt lévő érszakaszokban a thrombocyta adhézió és aggregáció mediátora. A molekula öröklött vagy szerzett abnormalitása áll a kb. 1%-os gyakoriságú von Willebrand betegség (VWB) hátterében. Valószínű, hogy ez a molekula domináns helyen áll a vascularis haematologiai betegségek (szív- és érrendszeri megbetegedések) hátterében is. Kutatásaink a VWF nyíróerő-függő struktúrájának és funkciójának megértésére irányulnak. Általunk választott adhezív vagy thrombogen felszínen, változtatható rheologiai paraméterek mellett, in vitro rendszerben vizsgáljuk az áramló teljes vérből vagy annak izolált faktorait tartalmazó oldatból a felszínhez kapcsolódó molekulákat, struktúrákat és a képződő thrombust. Kísérleteink során különböző eredetű -normál, beteg, tenyésztett endothel sejt által szekretált (igen nagy multimerek) és rekombináns- VWF-t szándékozunk használni. Fény-, konfokális lézer- és atomerő mikroszkópos, áramlási citometriás, tömegspektrometriás, különböző analitikai, preparatív biokémiai és immunokémiai módszerek, valamint fág technológia alkalmazását tervezzük. A kutatások a thrombocyták és az endothel sejtek, valamint az extracelluláris mátrix közötti összehangolt folyamatról szolgáltatnak új adatokat, ezáltal a normál haemostasis és a vascularis haematologiai betegségek mechanizmusának jobb megismerését és hatékonyabb gyógyítását eredményezhetik.
Summary
Von Willebrand Factor (VWF) is the highest molecular weight glycoprotein in the circulation, synthetized by endothelial cells and megakaryocytes, its role is to mediate platelet-subendothelial matrix and platelet-platelet interactions at sites of high shear stress. Its defect, Von Willebrand Disease (VWD) is the most frequent inherited bleeding disorder, also growing evidence points to its dominant role in the pathogenesis of vascular hematological (including cardiovascular) diseases. Elucidation of the shear dependency of the structure and the function of VWF may aid us to improve our knowledge on normal hemostasis and thrombosis. To this effect, we are planning to investigate normal, patient’s and recombinant VWF as well as ultra large multimers purified from endothelial cell culture. The influence of fluid shear forces on VWF’s GPIb and collagen binding activity and its role in platelet adhesion are to be modeled in vitro, our flow chamber is suitable for the investigation of structures and molecules adhered to a chosen surface under variable rheological conditions. To detect the effect of shearing, we intend to utilize light-, confocal laser- and atomic force microscopy, mass spectrometry, analytical and preparative bio- and immunochemical methods, flowcytometry and phage technology. Our results may enable us to further elucidate the pathogenesis of vascular hematological diseases hence develop more efficient treatments and may promote improvement in the diagnosis of VWD.




 

Final report

  
Results in Hungarian
A von Willebrand faktor (VWF) egy nagy molekulatömegű azonos alegységekből felépülő glikoprotein, mely alegységenként kollagén és thrombocyták számára szolgáló kötőhellyel is rendlekezik. A VWF és a thrombocyták jelen vannak a keringésben azonban összekapcsolódásuk csak akkor következik be, ha a VWF kapcsolatba lép a szubendotheliummal és/vagy nagy áramlási nyíróerők lépnek fel. 1. Vizsgáltuk a szabályozás hátterében feltételezhető konformációváltozást, ehhez a. tisztított VWF-ot, és thrombocytákat modellező GPIb-vel fedett polisztirol gyöngyöket hoztunk létre. Utóbbiakról igazoltuk, hogy aktív konformációjú GPIb található a felszínükön és képesek VWF kötésére. b. Fág technológiával kerestük a VWF konformáció függő, thrombocyta adhézióban szerepet játszó epitópjait. Három szelekciós kör után olyan peptid szekvenciát sikerült azonosítanunk, amely gátolja a VWF-kollagén kölcsönhatást. 2. A VWF adhezív funkciója függ az oligomerek méretétől, ezért a. a VWF polimerizáltságának mértékét leíró módszert hoztunk létre, amely továbbfejlesztett SDS-agaróz elektroforézist követő denzitometriás adatok általunk kifejlesztett számítógépes analízisén alapul b. A VWF kollagén kötő aktivitása ugyancsak függ a multimerek méretétől. Vizsgáltuk a különböző típusú humán kollagének (I és III) VWF kötő tulajdonságait. Az ezt mérő módszert alkalmassá tettük magas VWF antigén szint esetén is a mérésre. Folyamatban van módszereket nagy klinikai beteganyagon való alkalmazása. Közlemények száma: 11
Results in English
Von Willebrand factor (VWF) is one of the key proteins of platelet adhesion. The high molecular weight homooligomer, with a collagen and a platelet binding site in each subunit. It is circulating in the bloodstream together with platelets, however, the VWF-platelet reaction does not occur, unless VWF is attached to the subendothelial collagen and/or fluid shear forces are present. 1. We studied the hypothesized conformational changes responsible for the regulation a. We developed a method to purify VWF and created GPIb coated polystyrene beads to model platelets, and demonstrated that GPIb is immobilized in an active conformation and capable of binding VWF. b. We used phage technology to identify the conformation dependent platelet binding epitopes of VWF and a peptide sequence which is capable of inhibiting the VWF-collagen interaction found. 2. Adhesion activity of VWF is dependent on the size of oligomers, therefore: a. We developed a method to describe the extent of polymerization of VWF, which is based on our computational method applied to the densitometric curves of our improved SDS-agarose gelelectophoresis technique. b. The collagen binding of VWF is also dependent on the size of VWF oligomers. We evaluated the collagen binding properties of different human collagen types (I and III), and improved the present methods, to enable measurements in the high VWF antigen range. Application of the methods in clinical studies is going on. Number of publications: 11
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=62317
Decision
Yes





 

List of publications

  
Udvardy ML, Szekeres-Csiki K and Hársfalvi J: Novel evaluation method for densitometric curves of von Willebrand Factor multimers and a new parameter (MMW) to describe the degree of multimerisation, Thromb Haemost 102, 412-417, 2009
Tóth J, Kappelmayer J, Udvardy ML, Szántó T, Szarvas M, Rejtő L, Soltész P, Udvardy M and Hársfalvi J: Increased platelet glycoprotein Ib receptor number, enhanced platelet adhesion and severe cerebral ischemia in a patient with polycythaemia vera, Platelets 20, 282-287, 2009
Gombos T, Mako V, Cervenak L, Papassotiriou J, Kunde J, Harsfalvi J, Förhécz Z, Pozsonyi Z, Borgulya G, Jánoskuti L, Prohaszka Z: Levels of von Willebrand factor antigen and von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity predict clinical events in chronic heart failure., Thrombosis and Hemostasis(3):573-80, 2009
Szanto T, Vanhoorelbeke K, Toth G Vandenbulcke A, Toth J, Noppe W, Deckmyn H, Harsfalvi J: Identification of a VWF peptide antagonist that blocks platelet adhesion under high shear conditions by selectively inhibiting the VWF-collagen interaction, J Thromb Haemost(10):1680-7, 2009
Szanto T, Schlammadinger A, Staelens S, De Meyer SF, Freson K, Pareyn I, Vauterin S, Harsfalvi J,: The A/T1381 polymorphism in the A1-domain of von Willebrand factor influences the affinity of von Willebrand factor for platelet glycoprotein Ibalpha., Thromb Haemost. 2007 Jul;98(1):178-85, 2007
Szanto T, Schlammadinger A, Salles I, Pareyn I, Vauterin S, Harsfalvi J, Vanden Bulcke AM, Deckmyn H, Vanhoorelbeke K: Type 2B von Willebrand disease in seven individuals from three different families: phenotypic and genotypic characterization, Thromb Haemost. 2007 Jul;98(1):251-4., 2007
Mendelboum, S.R., Horváth, A., Aradi, J., Bagoly, Z., Fazakas, F., Batta, Z., Muszbek, L., Hársfalvi, J: 4-thio-deoxyuridylate-modified thrombin aptamer and its inhibitory effect on fibrin clot formation, platelet aggregation and thrombus growth on subendothelial matrix., J Thromb Haemost. 6(10):1764-71, 2008
Papp, M Lakatos, PL Harsfalvi, J Gyula, F Karoly, P Udvardy, M Molnar, T Farkas, K Ferenc, N Veres, G Laszlo, L Kovacs, A Dinya, T Kocsis, AK Janos, P Istvan, A: Mannose-binding lectin level and deficiency is not associated with inflammatory bowel diseases, disease phenotype, serology profile, and NOD2/CARD15 genotype in a large Hungarian cohort, HUMAN IMMUNOLOGY 71;407-13, 2010
Szekeres-Csiki K, Udvardy ML, Papp M, Mendelboum S, Hársfalvi J: A von Willebrand Faktor kollagénkötő aktivitását mérő módszer, Magyar Belorvosi Archivum Supplementum, (2):28, 2007
Szekeres-Csiki K, Udvardy ML, Varga-Fekete T, Harsfalvi J: Von Willebrand faktor és laboratóriumi diagnosztikai szerepe, Erdélyi Múzeum Egyesület, Orvostudományi Értesítő. 81 (1): 45-48, 2008
Molvarec A, Rigó J, Bõze T, Derzsy Z, Cervenak L, Makó V, Gombos T, Udvardy ML, Hársfalvi J and Prohászka Z: Increased plasma von Willebrand factor antigen levels but normal von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity in preeclampsia, Thromb Haemost 101, 305-11., 2009
Udvardy ML, Kappelmayer J, Hársfalvi J: Glycocalicin coated beads for studying platelet GPIb function, Platelets, 2007; 18(1): 98, 2006
Szarvas M, Oparaugo P, Udvardy ML, Toth J, Szanto T, Daroczi L, Vereb G, Harsfalvi J.: Differential platelet deposition onto collagen in cone-and-plate and parallel plate flow chambers, Platelets 17(3):185-90, 2006



Back »