Physical Chemistry and Theoretical Chemistry (Council of Physical Sciences)
50 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
50 %
Panel
Chemistry 1
Department or equivalent
Institute of Chemistry (Eötvös Loránd University)
Participants
Bodor, Andrea Domokos, Klarissza Harmat, Veronika Hudáky, Ilona Juhász, Tünde Kiss, András László Láng, András Pohl, Gábor Polgár, László Szeltner, Zoltán
Starting date
2007-07-01
Closing date
2012-02-29
Funding (in million HUF)
32.950
FTE (full time equivalent)
13.53
state
closed project
Summary in Hungarian
Felfedeztünk egy szerin peptidáz családot, a prolil oligopeptidáz családot, melynek tagjai egy peptidáz doménből és egy b-propellerből állnak, amit a prolil oligopeptidáz kristályszerkezetének meghatározásával állapítottunk meg. Most a család egy másik tagját, az acilaminoacil peptidázt kívánjuk vizsgálni. Szemben a monomer prolil oligopeptidázzal ez az enzim dimér vagy tetramér alakban fordul elő származásától függően. Az oligomerizáció szerepét egy hipertermofil bakteriális enzimnél vizsgáljuk, amelynek most határozták meg a szerkezetét. Ez lehetővé teszi, hogy helyspecifikus mutagenezissel fokozatosan gyengítsük, illetve megszüntessük az alegységek közötti kölcsönhatást. A különböző formákat kinetikai és fizikai (röntgendiffrakció, NMR-spektroszkópia, DSC, CD, denaturáció) szempontból analizáljuk. Mutagenezissel vizsgáljuk a katalitikus triádnak és az oxianion kötőhelynek a katalízishez való hozzájárulását, valamint a hőstabilitásért felelős tényezőket. Megkíséreljük a propeller domént a peptidáztól mutagenesis segítségével eltávolítani, s így azt oligopeptidázt proteinázzá alakítani, aminek alapvető analitikai és biotechnológiai jelentősége van.
Summary
We have discovered a serine peptidase group, the prolyl oligopeptidase family. Each member of the family is composed of a peptidase and a b-propeller domain, which we established by the determination of the crystal structure of prolyl oligopeptidase. We are going to study another member of the family, the acylaminoacyl peptidase that, in contrast to the monomer prolyl oligopeptidase, is a dimer or a tetramer, depending on its source. The importance of oligomerization will be examined with a hyperthermophilic enzyme, the structure of which has recently been determined. This allows us to phase out and finally abolish the interaction between the subunits by mutagenesis, and analyze the resulting forms by kinetic and physical (X-ray crystallography, NMR spectroscopy, DSC, CD, denaturation) methods. The contribution of the catalytic triad and the oxyanion binding site to the catalysis, as well as the factors responsible for the heat stability, will be examined using site-specific mutagenesis. An attempt will be made to separate the propeller from the peptidase domain, thereby transforming the oligopeptidase into proteinase, which is of analytical and biotechnological importance.
Final report
Results in Hungarian
A kutatás fő célja az egyikünk által felfedezett és jellemzett prolil oligopeptidáz családhoz tartozó enzimek (prolil oligopeptidáz, acilaminoacil peptidáz) működési mechanizmusának részletes tisztázása és különböző ligandumokkal képezett komplexeinek szerkezeti elemzése volt. Az enzimek különböző variánsainak működését kombinált módszerekkel, oldatkinetikai és fehérjekrisztallográfiai vizsgálatokkal, valamint molekulamodellezéssel jellemeztük. Megállapítottuk, hogy ahhoz, hogy a katalitikus hely aktív konformációba billenjen, nem elegendőek egy kisméretű szubsztráttal kialakított nem-kovalens komplex kölcsönhatásai, hanem az enzim becsukódása és interdomén kölcsönhatásainak átrendeződése szükséges - ez biztosítja, hogy nagyobb polipeptideket és fehérjéket az enzim nem hidrolizál el.
Analógiát találtunk több más fehérje (kalmodulin, dUTPáz és MASP-1), valamint az acilaminoacil peptidáz ligandumkötési mechanizmusa között. A kötőhely nyitottságának mértéke, és becsukódási képessége összefüggésbe hozható a szélesebb szelektivitással (kalmodulin és MASP-1). Az aktív hellyel közvetlenül nem érintkező konzervált aminosavak távol ható, konzervált hidrogénhíd-hálózatok révén vesznek részt a szubsztrát stabilizálásában (dUTPáz).
A PCM modellel kiegészített kvantumkémiai módszerrel vizsgáltuk a fehérje gerinc proton és szén NMR kémiai eltolódásait a konformáció függvényében, és megállapítottuk, hogy a gázfázisú modellhez képest javult az egyezés a kísérleti adatokkal.
Results in English
The main goal of our studies was to clarify the detailed mechanism of action of enzymes, belonging to the prolyl oligopeptidase family, discovered by one of us, as well as structural analysis of their complexes with various ligands. Activity of enzyme variants was characterised by combined methods, like solution kinetics, protein crystallography and molecular modelling. We found that, in order to switch the active site into an active conformation, it is not enough to establish non-covalent interactions with small substrates, rather closing of the enzyme and reorganisation of the interdomain interactions is needed. This ensures that larger polypeptides and proteins are not hydrolysed by the enzyme.
We found an analogy among mechanisms of action of other proteins (calmodulin, dUTPase and MASP-1) and acylaminoacyl peptidase. The extent of opening at the binding site and ability to close can be related to broader selectivity (calmodulin and MASP-1). Conserved amino acid residues, not directly connected to the active site, participate in substrate stabilisation via extended, conserved H-bond networks (dUTPase).
We investigated NMR proton and carbon chemical shifts of the protein backbone as a function of the conformation with a quantum chemical method extended by the PCM model and found that that the agreement with experimental data improved as compared to the gas-phase model.
Harmat V, Domokos K, Menyhard DK, Palló A, Szeltner Z, Szamosi I, Beke-Somfai T, Náray-Szabó G, Polgár L: Structure and Catalysis of Acylaminoacyl Peptidase Closed and Open subunits of a Dimer Oligopeptidase, J. Biol. Chem. 286(3), 1987-1998, 2011
Dobó J, Harmat V, Beinrohr L, Sebestyén E, Závodszky P, Gál P: MASP-1, a promiscuous complement protease: structure of its catalytic region reveals the basis of its broad specificity, J Immunol. 183(2), 1207-14, 2009
Kovács E, Harmat V, Tóth J, Vértessy BG, Módos K, Kardos J, Liliom K: Structure and mechanism of calmodulin binding to a signaling sphingolipid reveal new aspects of lipid-protein interactions, FASEB J. first published on June 14, 2010 as doi:10.1096/fj.10-155614, 2010
Takács E, Nagy G, Leveles I, Harmat V, Lopata A, Tóth J, Vértessy BG: Direct contacts between conserved motifs of different subunits provide major contribution to active site organization in human and mycobacterial dUTPases, FEBS Lett. 584, 3047-3054, 2010
Kánai K, Arányi P, Böcskei Z, Ferenczy G, Harmat V, Simon K, Náray-Szabó G, Hermecz I: Prolyl oligopeptidase inhibition by N-acyl-propyrrolidine-type molecules, J Med Chem 51(23), 7514–7522, 2008
Szeltner Z, Kiss AL, Domokos K, Harmat V, Náray-Szabó G, Polgár L: Characterization of a novel acylaminoacyl peptidase with hexameric structure and endopeptidase activity, Biochim Biophys Acta Proteins and Proteomics 1794(8):1204-10, 2009
Menyhard DK: Conformational selection mechanism governs oxygen ligation to H-NOX proteins, Bioorg Med Chem Lett 21(12) 3523-3526, 2011
Leveles I, Róna G, Zagyva I, Bendes Á, Harmat V, Vértessy BG: Crystallization and preliminary crystallographic analysis of dUTPase from the Φ11 helper phage of Staphylococcus aureus, Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 67(Pt 11):1411-1413, 2011
Kiss AL, Palló A, Náray-Szabó G, Harmat V, Polgár L: Structural and kinetic contributions of the oxyanion binding site to the catalytic activity of acylaminoacyl peptidase, J Struct Biol 162(2), 312-323, 2008
Szeltner Z, Polgár L: Structure, function and biological relevance of prolyl oligopeptidase, Curr Protein Pept Sci 9(1), 96-107, 2008
Menyhárd DK, Keserű GM, Náray-Szabó G: Calmodulin in Complex with Proteins and Small Molecule Ligands: Operating with the Element of Surprise. Implications for Structure-Based Design, Curr Comp Aided Drug Des 5, 2009
