General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Starting date
2007-07-01
Closing date
2010-12-31
Funding (in million HUF)
14.667
FTE (full time equivalent)
1.58
state
closed project
Summary in Hungarian
Sok tanulmány összpontosított a fagocita NADPH-oxidáz aktiválásának a mechanizmusára, kevéssé ismert azonban, hogy milyen tényezők vesznek részt az előzetesen aktivált enzim működésének leállításában. Tisztázni kívánjuk, milyen fehérjék segítik az előzetesen aktivált fagocita NADPH-oxidáz inaktiválását. Több munkacsoport közleményeiben felveti, hogy a fagociták protonárama a NADPH-oxidázkomplexen keresztül jön létre. Mások azonban az oxidáznak csak protoncsatornát szabályozó szerepet tulajdonítanak. Két friss közlemény megtalálni véli a régóta keresett protoncsatorna molekulát egy feszültség-függő káliumcsatornához hasonló fehérje formájában, amit azonban granulocitákban nem sikerült kimutatni. Kísérleteink alapvető célkitűzése tehát a fagociták protonáramának a létrehozásához alapvetően szükséges fehérjék molekuláris azonosítása. Kísérleteinkhez neutrofil granulocita irányba differenciáltatott, illetve differenciálatlan PLB-985 sejteket fogunk használni. A fehérjék azonosításához a sejteket siRNS klónt tartalmazó virális vektorrokkal transzdukáljuk. A fenntartott oxidáz aktivitást, ill. a protoncsatorna aktivitás hiányát fluoreszcens eljárásokban teszteljük. A szűrőeljárásban pozitívnak bizonyuló siRNS klónok hatását a protoncsatorna aktivitásra teljes sejt patch-clamp módszerrel kívánjuk igazolni. Az aktivált oxidáz inaktiválásában szerepet játszó fehérjék és a protoncsatorna molekula azonosítása lehetőséget teremt olyan farmakológiai kutatások megindítására, melyek az oxidáz általi szabadgyök termelés célzott befolyásolására irányulnak.
Summary
Although tremendous efforts have been focused on the mechanisms involved in activation of phagocyte NADPH oxidase, the factors that control its inactivation are poorly understood. We would like to identify the proteins involved in the inactivation of a preactivated oxidase. The notion has been made by multiple groups that the proton current of phagocytes are mediated by the NADPH oxidase complex. Others, however, suggest that the oxidase fulfills only a regulatory role. Two recent publications claim to have found the long sought proton channel molecule in the form of a voltage-gated potassium channel like protein. Importantly, however, the presence of this protein in phagocytes could not be confirmed. Therefore, the fundamental aim of our planned experiments is to identify the proteins that are required for phagocyte proton channel function. For the planned experiments we will use the myeloid leukemia cell line PLB-985, either in its undifferentiated form or differentiated into neutrophil granulocyte like cells. To identify proteins of interest, into PLB cells viral vector constructs will be transduced, each containing a member of a siRNA library. Fluorescence based methodology will be used to test for prolonged oxidase activity and for lack of proton channel funtion. siRNA clones that prove positive in the screening will be tested for their effect on proton channel activity applying the whole-cell patch-clamp approach. Identifiing proteins involved in oxidase inactivation and proton channel fuction will allow us to plan pharmacological studies aimed to specifically influence the activity of phagocyte NADPH oxidase.
Final report
Results in Hungarian
Feszültségfüggő protonáramot (IHv) sok sejttípusban kimutattak, de a legtöbb vizsgálatot emberi granulocitákban végezték. Fagocitákban a protonáramért felelős protoncsatorna feltételezett szerepe az aktivált Nox2 (a fagocita NADPH-oxidáz komplex központi enzime) működésének támogatása a légzési robbanás során. 2006-ban klónozták a Hv1 fehérjét, mely feszültségfüggő proton csatornaként működik, és Hv1-re nézve génhiányos egerek fehérvérsejtjeiben az légzési robbanás csökkenését tapasztalták. Emberi fehérvérsejtekben azonban kevés ismerettel rendelkezünk a Hv1 fehérjéről. Vizsgálataink középpontjába ezért az emberi fehérvérsejtek által termelt Hv1 fehérje molekuláris és celluláris szintű jellemzését állítottuk. Megvizsgáltuk továbbá a Hv1 és Nox2 kifejeződés viszonyát. Eredményeink alapján a Hv1 a granulociták felszínén és intracelluláris membránjaiban található. A Hv1 molekula homodimer és monomer formában egyaránt kifejeződik fehérvérsejtekben. A Hv1 fehérje emberi fehérvérsejtekben is szükséges a protonáram létrejöttéhez, kifejeződésének gátlása ugyanis csökkenteti az IHv amplitúdóját különböző humán eredetű fehérvérsejt-vonalakban. Nyugvó granulocitákban a Hv1 és Nox2 kolokalizációt mutat, és aktivációkor a két fehérje azonos membránokban dúsul (pl. fagoszómák falában). Végezetül a Hv1 kifejeződés masszív gátlása a PLB-985-ös emberi granulocita sejtvonalban is a az légzési robbanás csökkenéséhez vezet.
Results in English
Voltage-gated proton current (IHv) has been characterized in several cell types, but the majority of the data was collected in phagocytes, especially in human granulocytes. The prevailing view about the role of IHv in phagocytes is that it is an essential supporter of the intense and sustained activity of Nox2 (the core enzyme of the phagocyte NADPH oxidase complex) during respiratory burst. Recently Hv1, a voltage-gated proton channel was cloned, and leukocytes from Hv1 knockout mice display impaired respiratory burst. On the other hand, hardly anything is known about Hv1 in human granulocytes. Therefore, we set out to define the main characteristics of Hv1 expression in human granulocytes on the cellular, subcellular and molecular level and also its relationship to Nox2. Our results indicate that Hv1 is expressed in intracellular membranes and on the cell surface of granulocytes. Native Hv1 molecule is expressed in dimer and monomer form in different leukocytes and its expression is required for normal voltage-gated proton currents in different leukemia cell lines indicating that Hv1 is indispensable for IHv in human leukocytes as well. Additionally, Hv1 and Nox2 colocalize in granulocytes, and both accumulate in the same membrane compartment (e.g. in phagosomal wall) upon activation. Furthermore, severely impaired Hv1 expression can reduce the maximum rate of superoxide release in a human granulocyte cell line PLB-985.
