Az ischaemiás agykárosodásban szerepet játszó TrpM2 kationcsatorna szerkezet-funkció vizsgálata
Title in English
Structure-function studies of the TrpM2 cation channel involved in ischaemic brain damage.
Keywords in Hungarian
patch-clamp, ADP-ribóz pirofoszfatáz, aktív centrum mutáns, inaktiváció, Ca2+, oxidatív stressz, ciklikus ADP-ribóz
Keywords in English
patch-clamp, ADP-ribose pyrophosphatase, active site mutant, inactivation, Ca2+, oxidative stress, cyclic ADP-ribose
Discipline
Molecular and cellular neuroscience (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Panel
Neurosciences
Department or equivalent
Dept. of Medical Biochemistry (Semmelweis University)
Participants
Szöllősi, András
Starting date
2007-07-01
Closing date
2010-07-31
Funding (in million HUF)
11.250
FTE (full time equivalent)
1.41
state
closed project
Summary in Hungarian
Agyi ischaemiát követő sejthalál kifejlődésében fontos szerepet játszanak a sejtmembrán TrpM2 ioncsatornái. Ezeket a Ca2+-ra is permeábilis nem-szelektív kationcsatornákat a mitochondriumból felszabaduló ADP-ribóz (ADPR) aktiválja, de sok más NAD metabolit, valamint Ca2+ és hidrogenperoxid (H2O2) is befolyásolják. E hatások molekuláris mechanizmusa ismeretlen. A TrpM2 C-terminális doménje aktív ADPR-pirofoszfatáz (ADPRáz), de ezen enzimatikus aktivitás szerepe tisztázatlan.
A jelen kutatás révén arra szeretnénk választ kapni, milyen molekuláris mechanizmussal szabályozza a különböző ligandok (ADPR, ciklikus ADPR, NAADP, AMP, Ca2+, H2O2) bekötődése, valamint a TrpM2 saját enzimatikus aktivitása, a csatorna pórus kapuzását. Natív (patkány) és rekombináns (patkány és humán), vad-típusú és mutáns, TrpM2 fehérjék működését fogjuk összehasonlítani. A csatorna pórus kapuzását patch-clamp mérésekkel, a megtisztított C-terminális domén enzimatikus funkcióját ADPRáz aktivitás mérésekkel jellemezzük. Meghatározzuk a fenti ligandok hatását a csatorna kinetikájára egyenként illetve párokban. Megvizsgáljuk, hogy kimutatható-e korreláció a különböző kísérleti körülmények (mutációk, hőmérséklet, pH, stb.) között mért ADPRáz aktivitás valamint a kapuzást jellemző kinetikai paraméterek valamelyike között.
A natív és rekombináns, illetve a humán és patkány, csatornák összevetése a molekuláris környezet szerepének, illetve fajspecifikus tulajdonságoknak a felismerését segítheti elő.
Summary
TrpM2 ion channels are found in the plasma membrane and play a central role in the development of cell death following ischaemic brain injury. These Ca2+-permeable nonselective cation channels are activated by ADP-ribose (ADPR) released from mitochondria, and modulated by other NAD metabolites as well as Ca2+ and hydrogenperoxide (H2O2). The molecular mechanisms of these effects are unknown. The C-terminal domain of TrpM2 is an active ADPR-pyrophosphatase (ADPRase), but the role of this enzymatic activity is unclear.
Our aim is to reveal the molecular mechanism by which binding of ligands (ADPR, cyclic ADPR, NAADP, AMP, Ca2+, H2O2) and the enzymatic activity of the C-terminal domain regulate gating of the channel pore. We will compare the function of native (rat) and recombinant (rat and human), wild-type and mutant, TrpM2 proteins. Channel gating will be characterized in patch-clamp studies, enzymatic function of the purified C-terminal domain will be assessed by measurement of ADPRase activity. We will determine the effect on channel gating kinetics of the above ligands when applied individually or in pairs. We will seek correlations, under various experimental conditions (mutations, temperature, pH, etc.), between ADPRase activity and any of the kinetic parameters that describe channel gating.
Comparison of native and recombinant, or human and rat, TrpM2 will help to elucidate the role of the channel's molecular environment, as well as any species-specific differences.
Final report
Results in Hungarian
Megállapítottuk, hogy a csatornát 4 Ca2+ ion kötődése aktiválja. Az aktiváció a Monod-Wymann-Changeux mechanizmust követi, 1 Ca2+ kötődése ~33-szorosra, a 4 ion összesen ~10^6-szorosra, növeli a nyitott-csukott egyensúlyi állandót. A Ca2+ kötőhelyei a kaputól intracelluláris irányban találhatók egy védett üregben, közel a pórus nyílásához. A nyitott póruson beáramló Ca2+ telítésben tartja az aktiváló helyeket, ezért intakt sejtekben, ADPR jelenlétében, egy rövid Ca2+ szignál is elnyújtott TRPM2 aktivitást válthat ki.
Megállapítottuk, hogy az ADPR nagy affinitással (K1/2=1uM) aktivál, de az ADPR-hidrolízisnek a csatorna csukódásában játszott szerepét nem tudtuk tisztázni. Az ADPRázok konzervált "Nudix-box" motívuma (REFXEE) a TRPM2 NUDT9-H doménjében atípusos (RILRQE). A NUDT9 enzimben az EF->IL mutáció 1%-ára csökkenti, az EE->KK mutáció felfüggeszti az ADPRáz aktivitást. Létrehoztunk egy "inaktív" QE->KK és egy "hiperaktív" IL->EF TRPM2 mutánst, de e 4 egyedi és 2 dupla mutáció egyike sem befolyásolta az ADPR iránti affinitást illetve a csukódási sebességet.
Intakt sejtekben az AMP gátolta, míg a H2O2, a ciklikus ADPR (cADPR), és a nikotinsav-adenin-dinukleotid-foszfát (NAADP) aktiválták a TRPM2-t, és fokozták ADPR iránti érzékenységét. Izolált membrán patch-ben megállapítottuk, hogy a H2O2, az AMP, és a cADPR közvetlenül nem hatnak a TRPM2-re, míg az NAADP és az NAAD kis affinitású parciális agonisták. Tehát intakt sejtekben e modulátorok hatásai közvetettek.
Results in English
We have revealed that the channel is activated by binding of 4 Ca2+ ions, following the Monod-Wymann-Changeux mechanism. Binding of 1 Ca2+ increases the closed-open equilibrium constant by ~33-fold, the 4 ions altogether by ~10^6-fold. The Ca2+ binding sites are found intracellularly of the gate, in a protected crevice, near the pore entrance, and are kept saturated by Ca2+ flowing through the open pore. Thus, in intact cells, in the presence of ADPR, a single brief Ca2+ spark can elicit prolonged TRPM2 channel activity.
We have shown that ADPR activates the channel with high affinity (K1/2=1 uM), but could not clarify the role of ADPR hydrolysis in channel closure. The conserved ADPRase "Nudix-box" motif (REFXEE) is atypical in the NUDT9-H domain of TRPM2 (RILRQE). The EF->IL mutation decreases ADPRase activity of the NUDT9 enzyme to ~1%, while the EE->KK mutation completely abolishes it. We constructed an "inactive" QEKK and a "hiperactive" IL->EF TRPM2 mutant, but neither of the 4 single and 2 double mutants affected ADPR affinity or channel closing rate.
In intact cells AMP inhibits, while H2O2, cyclic ADPR (cADPR), and nicotinic acid-adenin-dinucleotide-phosphate (NAADP) activate TRPM2, and enhance its sensitivity to ADPR. We have found that direct application of H2O2, AMP, and cADPR in isolated patches does not affect the channels, while NAADP and NAAD are low-affinity partial agonists. Thus, in intact cells the effects of these modulators are indirect.
Tóth B., Csanády L: Identification of direct and indirect effectors of the transient receptor potential melastatin 2 (TRPM2) cation channel, J Biol Chem doi/10.1074/jbc.M109.066464, 2010
Balázs Tóth and László Csanády: Pore collapse underlies irreversible inactivation of TRPM2 channel currents, PNAS DOI: 10.1073/pnas.1204702109, 2012
Csanády L: Permeating proton found guilty in compromising TRPM2 channel activity., J. Physiol. 588:1661-1662, 2010
Csanády L: Degenerate ABC composite site is stably glued together by trapped ATP., J Gen Physiol 135:395-398, 2010
Csanády L, Vergani P, Gadsby DC: Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations., Proc Natl Acad Sci USA 107:1241-1246, 2010
Csanády L, Törőcsik B: Four Ca2+ ions activate TRPM2 channels by binding in deep crevices near the pore but intracellularly of the gate, J Gen Physiol 33:189-203., 2009
Csanády L: Application of rate-equilibrium free energy relationship analysis to non-equilibrium ion-channel gating mechanisms., J Gen Physiol 134:129-136, 2009
Chinopoulos C, Vajda Sz, Csanády L, Mándi M, Mathe K, Adam-Vizi V: A Novel Kinetic Assay of Mitochondrial ATP-ADP Exchange Rate Mediated by the ANT., Biophys J 96:2490-2504., 2009
Csanády L, Mindell JA: The twain shall meet: channels, transporters and things between… Meeting on“Membrane Transport in Flux: the ambiguous interface between channels and pumps”, EMBO Rep 9: 960-965, 2008
Chan KW, Wheeler A, Csanády L: Sulfonylurea Receptors Type 1 and 2A Randomly Assemble to Form Heteromeric KATP Channels of Mixed Subunit Composition., J Gen Physiol 131:43-58, 2008
