Human dUTPase: cooperativity and cellular interactions  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
68229
Type K
Principal investigator Vértessy G., Beáta
Title in Hungarian Humán dUTPáz: kooperativitás és sejtbeli kölcsönhatások
Title in English Human dUTPase: cooperativity and cellular interactions
Keywords in Hungarian dUTPáz, timinmentes sejthalál, tranziens kinetika, fehérjekrisztallográfia, kölcsönható hálózat, TAP-tag kis fehérjékre
Keywords in English dUTPase, thymine-less cell death, transient kinetics, X-ray protein crystallography, interacting network, TAP-tag for small proteins
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)50 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)50 %
Panel Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent Institute of Enzymology, BRC, Hungarian Academy of Sciences
Participants Barabás, Orsolya
Horváth, András
Málnási Csizmadia, András
Németh, Veronika
Takács, Enikő
Tóth, Judit
Varga, Balázs
Starting date 2007-07-01
Closing date 2011-07-31
Funding (in million HUF) 20.241
FTE (full time equivalent) 13.58
state closed project
Summary in Hungarian
Előzmények és kutatási terv: A dUTPáz a preventív DNS-javítás és a timidilát bioszintézis nélkülözhetetlen enzime. Ráksejtekben és vírusfertőzött sejtekben a dUTPáz gátlása ígéretes új stratégia p53-független apoptózis indukálására. Kitűzött céljaink: i) a humán dUTPáz kooperatív és allosztérikus működésének megértése, ii) a dUTPáz és három nemrég azonosított sejtbeli kölcsönható fehérjepartnere (Hsc70, AP endonukleáz és PARP-kötő fehérje) által képzett komplexek szerkezeti tanulmányozása és iii) a humán dUTPáz kölcsönható hálózatának tanulmányozása egy újszerű TAP-tag módszerrel. A jelen pályázat egyaránt összpontosít szerkezeti biológiai: nagyfelbontású röntgenkrisztallográfia, tranziens enzimkinetika, mikrokalorimetria, felszíni plazmon rezonancia, és molekuláris/sejtbiológiai megközelítésekre: az endogén humán dUTPáz in vivo helyettesítése E. coli enzimmel és a módosított TAP-tag módszer alkalmazása humán sejtekben.
Várható eredmények: A humán dUTPáz kooperatív jellegének alapos, kritikai tanulmányozása hozzájárul majd az enzim szabályozási mechanizmusának felderítéséhez. A dUTPáz és partnerei által létrehozott komplexek vizsgálata tisztázni fogja a kölcsönhatás szerkezeti alapjait, és rávilágít majd arra, milyen lehetőséget nyújtanak ezen komplexek a dUTPáz működésének szabályozására. A fehérje kölcsönhatási hálózat azonosítása későbbi sejtszintű vizsgálatok alapjait képezi majd.
Summary
Background and workplan: dUTPase is an essential factor in preventive DNA repair and thymidylate biosynthesis. Its targeting in cancer and virus-infected cells is a promising novel strategy to induce p53-independent apoptosis. Our aims are to i) understand cooperativity and allosterism in human dUTPase, ii) characterize dUTPase-Hsc70, dUTPase-AP endonuclease and dUTPase-PARP-binding protein complexes from structural viewpoint and iii) identify the cellular protein interacting network of human dUTPase by a novel double-tagged “TAP-tag” approach. The present proposal focusses on structural biology approaches: high-resolution X-ray crystallography, transient enzyme kinetics, microcalorimetry and surface plasmon resonance, as well as cell and molecular biology approaches: in vivo replacement of endogenous human dUTPase by the E. coli enzyme and TAP-tag pull-down of dUTPase interacting proteins from human cells.
Expected results: Critical assessment of the potential cooperative character of human dUTPase will contribute to deciphering the regulatory pathways of the enzyme. Characterisation of complexes formed by dUTPase and its protein partners will reveal the structural basis of these interactions and will also show if dUTPase activity might be modulated within the complexes. Protein network identification will form the basis for later cellular investigations.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Az enzimműködés mechanizmusának tisztázása és a katalitikus ciklus részletes leírása, valamint a humán dUTPáz sejtbeli siRNS csendesítése témákban jelentős cikkeket közöltünk, többek közt a JBC, Accounts Chem. Res és PNAS folyóiratokban. Fehérjekrisztallográfia, a 31P NMR, és a QM-MM számításos módszerek, valamint steady-state and tranziens enzimkinetikai módszerek együttes alkalmazása révén sikerült olyan egyedi intermediereket azonosítani, melyek hatékony gátlószerek tervezésében is szerepet játszhatnak. A humán dUTPáz gátlása rákterápiában lehet fontos. TAP-tag kísérleteinkben azonosítottuk az importin-alfa fehérjét, mint a humán dUTPáz egyik sejtbeli kölcsönható partnerét. Bizonyítottuk, hogy a nukleáris lokalizációs szignál (NLS) melletti foszforiláció kihat a dUTPáz intracelluláris lokalizációjára: a foszforilált fehérjét mimikáló mutáns kireked a sejtmagból. A vad típusú enzim, egy hiperfoszforilációt, valamint egy hipofoszforilációt mimikáló mutáns forma magi akkumulációját videomikroszkópos kísérletekkel hasonlítottuk össze. Megállapítottuk, hogy az utódsejtekbe jutó foszforilált dUTPáz pool a sejtciklus előrehaladtával, valószínűleg defoszforilációt követően újra akkumulálódhat a magban, de ez a folyamat lassú. Az NLS-környéki foszforiláció sejtciklushoz kötött mechanizmusát számos egyéb humán fehérjén is azonosítottuk – ez a folyamat általános jelentőségű lehet az utódsejtek magi proteómjának kialakításában.
Results in English
Significant articles were published in journals such as JBC, Accounts Chem Res and PNAS, covering the topics of the molecular mechanism of action, distinct steps in the catalytic cycle, and siRNA silencing of human dUTPase. We identified multiple unique intermediary states using a combined approach of X-ray crystallography, 31P NMR, computational chemistry and steady-state/transient enzyme kinetics. These intermediates may form the basis of inhibitor design against human dUTPase, a potential for novel anticancer drugs. Using TAP-tag experiments, we identified importin-alfa as a cellular interacting partner of human dUTPase. We showed that a specific phosphorylation in the vicinity of the nuclear localization signal (NLS) impedes nuclear import. Videomicroscopy was used to compare nuclear accumulation kinetics in daughter cells following mitosis for wild type, as well as fór hypo- and hyperphosphorylation mimicking mutants. We showed that the phosphorylated dUTPase pool that is transmitted to the daughter cells may again accumulate in the cytoplasm, but only after dephosphorylation and in a rather slow manner. We identified similar mechanism for numerous other human proteins – this process may possess general significance in shaping the nuclear proteome of daughter cells.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=68229
Decision
Yes





 

List of publications

  
Varga B, Barabás O, Kovári J, Tóth J, Hunyadi-Gulyás É, Klement É, Medzihradszky KF, Tölgyesi F, Fidy J, and Vértessy BG.: Active site closure facilitates juxtaposition of reactant atoms for initiation of catalysis by human dUTPase, FEBS Letters, 581(24):4783-8., 2007
Vértessy B.G.,Tóth J.: Keeping uracil out of DNA: physiological role, structure and catalytic mechanism of dUTPases, Accounts of Chemical Research 42(1):97-106., 2009
Tóth J, Varga B, Kovács M, Málnási-Csizmadia A, Vértessy B.G.: Kinetic mechanism of human dUTPase, an essential nucleotide pyrophosphatase enzyme, J Biol Chem, 282(46):33572-82., 2007
Varga B, Migliardo F, Takacs E, Vértessy BG, Magazù S, Mondelli C.: Scattering Studies on dUTPase Complex in Presence of Bioprotectant Systems, Chemical Physics, 345:250-258, 2008
Kovári J, Barabás O, Varga B, Békési A, Tölgyesi F, Fidy J, Nagy J, Vértessy BG: Methylene substitution at the α-β bridging position within the phosphate chain of dUDP profoundly perturbs ligand accommodation into the dUTPase active site, Proteins, 71(1):308-19., 2008
Varga B, Migliardo F, Takacs E, Vértessy BG, Magazù S: Experimental study on dUTPase-inhibitor candidate and dUTPase/disaccharide mixtures by PCS and ENS, Journal of Molecular Structure, 886:128–135, 2008
Varga B, Barabas O, Takacs E, Nagy, N., Nagy, P., and Vértessy, B. G.: Active site of mycobacterial dUTPase: Structural characteristics and a built-in sensor, Biochem. Biophys. Res. Comm., 373:8-13, 2008
. Spadiut O, Leitner C, Salaheddin C, Varga B, Vertessy BG, Tan TC, Divne C, Haltrich: Improving thermostability and catalytic activity of pyranose 2-oxidase from Trametes multicolor by rational and semi-rational design., FEBS J. Feb;276(3):776-92., 2009
Muha V, Zagyva I, Venkei Z, Szabad J, Vértessy BG.: Nuclear localization signal-dependent and -independent movements of Drosophila melanogaster dUTPase isoforms during nuclear cleavage, Biochem Biophys Res Commun. 2009 381(2):271-5., 2009
Takács E, Barabás O, Petoukhov MV, Svergun DI, Vértessy BG.: Molecular shape and prominent role of beta-strand swapping in organization of dUTPase oligomers, FEBS Lett. 2009 583(5):865-71., 2009
Varga B, Migliardo F, Takacs E, Vertessy B, Magazù S, Telling MT.: Study of solvent–protein coupling effects by neutron scattering, J Biol Phys, 36(2):207-220., 2010
Kovacs E, Tóth J, Vértessy BG, Liliom K.: Dissociation of calmodulin-target peptide complexes by the lipid mediator sphingosylphosphorylcholine: implications in calcium signaling, J Biol Chem, 285(3):1799-808., 2010
Merényi G, Kónya E, Vértessy BG.: Drosophila proteins involved in metabolism of uracil-DNA possess different types of nuclear localization signals, FEBS J. 2010 May;277(9):2142-56., 2010
Pukáncsik M, Békési A, Klement E, Hunyadi-Gulyás E, Medzihradszky KF, Kosinski J, Bujnicki JM, Alfonso C, Rivas G, Vértessy BG.: Physiological truncation and domain organization of a novel uracil-DNA-degrading factor, FEBS J. 2010 Mar;277(5):1245-59. Epub 2010 Feb 1., 2010
Kovacs E, Harmat V, Tóth J, Vértessy BG, Módos K, Kardos J, Liliom K.: Structure and mechanism of calmodulin binding to a signaling sphingolipid reveal new aspects of lipid-protein interactions, FASEB J. 2010 Jun 14. [Epub ahead of print], 2010
Takács E, Nagy G, Leveles I, Harmat V, Lopata A, Tóth J, Vértessy BG.: Direct contacts between conserved motifs of different subunits provide major contribution to active site organization in human and mycobacterial dUTPases, FEBS Lett. 2010 Jul 16;584(14):3047-54. Epub 2010 May 21., 2010
Pecsi I, Leveles I, Harmat V, Vertessy BG, Toth J.: Aromatic stacking between nucleobase and enzyme promotes phosphate ester hydrolysis in dUTPase, Nucleic Acids Res. 2010 Jul 2. [Epub ahead of print], 2010
Bozóky Z, Róna G, Klement É, Medzihradszky KF, Merényi G, Vértessy BG, Friedrich P.: Calpain-catalyzed proteolysis of human dUTPase specifically removes the nuclear localization signal peptide., PLoS One., 2011
Merényi G, Kovári J, Tóth J, Takács E, Zagyva I, Erdei A, Vértessy BG.: Cellular response to efficient dUTPase RNAi silencing in stable HeLa cell lines perturbs expression levels of genes involved in thymidylate metabolism., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2011
Pécsi I, Szabó JE, Adams SD, Simon I, Sellers JR, Vértessy BG, Tóth J.: Nucleotide pyrophosphatase employs a P-loop-like motif to enhance catalytic power and NDP/NTP discrimination., Proc Natl Acad Sci U S A., 2011
Leveles I., Róna G., Zagyva I., Bendes Á., Harmat V. and Vértessy B. G.: Crystallization and preliminary crystallographic analysis of dUTPase from the [varphi]11 helper phage of Staphylococcus aureus, Acta Cryst. (2011). F67, 1411-1413, 2011
Poppe L, Paizs C, Kovács K, Irimie FD, Vértessy B.: Preparation of unnatural amino acids with ammonia-lyases and 2,3-aminomutases., Methods Mol Biol. 2012;794:3-19., 2012




 

Events of the project

  
2011-04-28 21:01:20
Résztvevők változása
2008-08-14 12:55:42
Kiegészítő támogatás beolvasztása



Back »