retroviral proteases, life-cycle of retroviruses, proteomics
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
40 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Department of Biochemistry and Molecular Biology (University of Debrecen)
Participants
Bagossi, Péter Bander, Pálma Boross, Péter Eizert, Helga Joóné Matúz, Krisztina Miklóssy, Gabriella Sperka, Tamás
Starting date
2007-07-01
Closing date
2011-12-31
Funding (in million HUF)
19.232
FTE (full time equivalent)
18.15
state
closed project
Summary in Hungarian
Bár számos információval rendelkezünk a retrovírusokkal kalpcsolatban, több lényeges kérdés még tisztázatlan maradt, különös tekintettel a fertőzés korai szakaszának történéseire. Bár korábbi vizsgálatok arra utaltak, hogy a retrovirális proteáz lényeges szerepet játszik ebben a szakaszban, a publikált eredmények ellentmondóak, és a hatásmechanizmus sem tisztázott. A proteáz szerepének megértése a vírusfertőzés korai szakaszában új antivirális stratégiák kidolgozásához vezethet, melyek képesek a virus integrációjának blokkolására és/vagy alkalmasak rezisztens human immunodeficiencia virus (HIV) által kiváltott fertőzés gátlására. Reprezentatív retrovírusok összehasonlító in vitro sejtkultúrás vizsgálatával igazolni viszgálni kívánjuk a proteáz általános szerepét a fertőzés korai fázisában, valamint vizsgálni kívánjuk proteáz inhibítorok hatását ebben a fázisban. Proteomikai megközelítéssel vizsgálni tervezzük a virális mag/preintegrációs complex-asszociált celluláris fehérjéket mint a proteolitikus processzálás potenciális targetjei, valamint a temporális változást a celluláris proteómban a vírusfertőzés korai fázisában. Továbbá vizsgálni kívánjuk retrovírusok mutációkat hordozó kapszid és a nukleokapszid fehérjéinek proteolitikus hasítását, ezen mutációkat bejuttatjuk fertőzőképes vírusklónokba, és vizsgáljuk a proteolitikus hasíthatóság valamint a fertőzőképesség összefüggését.
Summary
Although a great amount of information is available on retroviruses, several questions on the viral life-cycle remain to be answered, especially regarding the early phase of infection. Although previous studies suggested an important role for the retroviral protease in it, findings are controversial and the mechanism of action has not been clarified. Understanding the role of the protease in the early phase of retroviral infection may help to develop new antiviral strategies to block viral integration and/or to design new inhibitors suitable to block resistant human immunodeficiency virus (HIV) variants. We would like to verify the role of the viral protease in the early-phase of viral replication by using in vitro comparative cell culture assay systems for representative retroviruses, and testing the effect of protease inhibitors in the early phase. Proteomics approach will be utilized to identify viral and core/preintegration complex-associated cellular proteins as target of the PR processing and to study the temporal changes of the cellular proteome during the early phase of viral infection. Furthermore, we plan to study the proteolytic processing of mutant retroviral capsid and nucleocapsid proteins, introduce these mutations into infectious virus clones and study the correlation between proteolytic susceptibility and viral infectivity.
Final report
Results in Hungarian
A kapsztid (CA) és nukleokapszid (NC) hasítási vizsgálatok elősegítésére számos retrovirális proteázt (PR) jellemeztük, többek között a human T-sejtes leukémia valamint a xenotróp egér leukemia vírus-rokon vírusét is. Igazoltuk a korábban azonosított HIV-1 CA hasítási helyeket, valamint egy új helyet is azonosítottunk. Számos egyszeres és többszörös mutációt hoztunk létre rekombináns, hexahisztidin farokkal expresszált CA fehérjében. A mutánsok proteolitikus érzékenysége jó egyezést mutatott a várt hatásokkal. Ugyanakkor még nyolc mutációval sem sikerült teljesen HIV-1 PR-rezisztenssé tenni a fehérjét. A vizsgált mutációkat bevittük egy harmadik generációs öninaktiválódó lentivírus rendszerbe is. Mind a proteáz érzékeny illetve hasítást gátló CA mutációkat tartalmazó vírusok fertőzőképessége csökkent. Meghatározott vagy jósolt NC fehérje hasítási helyeket tartalmazó oligopeptideket valamint rekombináns NC fehérjéket vizsgáltunk mint PR szubsztrátok. Eredményeink alapján nem csak lentivírus NC fehérjék lehetnek PR szubsztrátok. A virológiai vizsgálatok elősegítésére vizsgáltuk a HIV-1 PR specificitását NC alapú szubsztrátokkal, valamint számos „revertáns” szubsztrátok terveztünk, melyekben a cink-újj motívum belső része nem változott, a hasíthatóságot külső oldalláncok változtatása biztosította. Vizsgáltuk a celluláris protóm változását HIV-1 fertőzés során, és indukálódó fehérjéket azonosítottunk.
Results in English
To facilitate the comparative capsid (CA) and nucleocapsid (NC) cleavage specificity studies, various retroviral proteases (PRs) were characterized including those of human T-cell lymthotropic and xenotropic murine leukemia virus-related viruses. We verified the previously found cleavage sites in CA of HIV-1 and identified a new one. Single and multiple cleavage site mutations were introduced into a recombinant his-tagged CA. The proteolytic susceptibility of the mutants was in good agreement with the expected changes. However, even eight mutations were not sufficient to make CA resistant towards HIV-1 PR. The studied mutations were introduced into a third generation self-inactivating HIV-1-based lentiviral system. Infectivity assays suggested, that both enhancing and proteolysis inhibitory mutations caused decrease in infectivity. We have studied oligopeptide substrates representing determined or predicted cleavage sites of retroviral nucleocapsid proteins, as well as recombinant NC forms. Cleavage data implied that cleavability of NC sequences might not be restricted to lentiviruses. To facilitate virological studies, we studied the HIV-1 PR specificity with NC-based substrates and designed “revertant” mutants in which cleavability was regained by introducing mutations into close vicinity of the zinc finger motifs. We have also studied the changes in the cellular proteome during the course of HIV-1 infection, and identified proteins with elevated expression.
Luis Menendez-Arias, Jozsef Tozser: HIV-1 protease inhibitors: effects on HIV-2 replication and resistance, Trends in Pharmacol Sci 29, 42-49., 2008
Janos Kadas, Peter Boross, Irene T. Weber, Peter Bagossi, Krisztina Matuz, Jozsef Tozser: C-terminal residues of mature human T-lymphotropic virus type 1 protease are critical for efficient dimerization and for catalytic activity., Biochem. J. 416(3):357-64., 2008
Gabriella Miklossy, Jozsef Tozser, Janos Kadas, Rieko Ishima, John M. Louis, Peter Bagossi: Novel macromolecular inhibitors of human immunodeficiency virus-1 protease, Protein Eng Des Sel, 21, 453-461, 2008
Helga Eizert, Palma Bander, Peter Bagossi, Tamas Sperka, Gabriella Miklossi, Peter Boross, Irene T. Weber, Jozsef Tozser: Amino acid preferences of retroviral proteases for amino-terminal positions in a type 1 cleavage site, J Virol 82, 10111-10117, 2008
Péter Bagossi, Pálma Bander, Beáta Bozóki, Jozsef Tozser: Discovery and significance of new human T-lymphotropic viruses: HTLV-3 and HTLV-4., Expert Rev Anti Infect Ther. 7(10):1235-49., 2009
Irene T Weber, Ying Zhang, Jozsef Tozser: HIV-1 protease and AIDS therapy. in Viral Proteases and Antiviral Protease Inhibitor Therapy., . Proteases in Biology and Disease Vol. 8 (Lendeckel, U., Hooper, N.M. eds) pp 25-46., 2009
Peter Boross, Peter Bagossi, Irene T. Weber, Jozsef Tozser: Drug targets in human T-lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) infection., Inf. Dis. Drug Targets, 9(2):159-71., 2009
Mi Li, Alla Gustchina, Krisztina Matuz, Jozsef Tozser, Sirilak Namwong, Nathan E. Goldfarb, Benn M. Dunn, Alexander Wlodawer: Structural and biochemical characterization of the inhibitor complexes of XMRV protease., FEBS J. 2011 Sep 23., 2011
Yunfeng Tie, Yuan-Fang Wang, Peter I. Boross, Ting-Yi Chiu, Arun K. Ghosh, Jozsef Tozser, John M. Louis, Robert W. Harrison, Irene T. Weber: Critical differences in HIV-1 and HIV-2 protease specificity for clinical inhibitors., Protein Sci. doi: 10.1002/pro.2019. [Epub ahead of print], 2012
