Deciphering the structural basis of protein-protein interactions and their selective inhibition via directed evolutionary methods  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
68408
Type K
Principal investigator Pál, Gábor
Title in Hungarian Fehérje-kölcsönhatások szerkezeti alapjainak feltárása és a kölcsönhatás szelektív gátlása irányított evolúciós eljárásokkal
Title in English Deciphering the structural basis of protein-protein interactions and their selective inhibition via directed evolutionary methods
Keywords in Hungarian fehérje-fejhérje kölcsönhatás, irányított evolúció, kombinatorikus biokémia, fág bemutatás, proteáz-inhibitor
Keywords in English protein-protein interaction, directed evolution, combinatorial biochemistry, phage display, protease inhibitor
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)100 %
Panel Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent Department of Biochemistry (Eötvös Loránd University)
Participants Gráf, László
Kocsis, Andrea
Starting date 2007-07-01
Closing date 2012-07-31
Funding (in million HUF) 19.210
FTE (full time equivalent) 3.74
state closed project
Summary in Hungarian
Jelen pályázat célja, hogy meghonosítsak egy irányított evolúciós molekuláris biológiai megközelítést, a fág-bemutatást, amit egy kaliforniai biotechnológiai cég, a Genentech Protein Engineering osztályán sajátítottam el. Elsőként itt vezették be ezt a stratégiát szisztematikus fehérjemérnöki munkák támogatására, és példájukat számos alapkutatással foglalkozó csoport követte. A fág-bemutatás során többmilliárdnyi fehérjevariánst állítunk elő. Az ezekből szelektált funkcióképes populáció statisztikus szekvencia-analízise megmutatja, hogy milyen aminosav sorrend kell egy adott funkció ellátásához, tehát az ahhoz szükséges szerkezet és dinamika biztosításához. A szelektált klónok emellett információban gazdag populációt jelentenek egyedi biofizikai mérésekhez. Ezen felül a kombinatorikus mutagenezisen és szelekción alapuló eljárással új funkciójú peptidek és fehérje variánsok hozhatók melyek ab initio tervezése még nem megoldott.
Célom, hogy ezzel a kombinatorikus módszerrel megválaszoljak egy sor olyan kérdést, melyekkel korábbi kutatásaim során találkoztam. Ilyen a szerin proteáz inhibitorok specifitásának, a létrejött proteáz-inhibitor komplex stabilitásának, illetve az inhibitorok helyes feltekeredésének szerkezeti háttere. E munka keretében célul tűztem ki azt is, hogy inhibitorokat fejlesszek ki két olyan humán szerin proteináz ellen, melyeknek nincs ismert kanonikus inhibitora. Az egyik az agyban kifejeződő IV-es tripszin, a másik a komplement aktiválódás lektin útvonalának kulcsenzime, a MASP2. Az agyi tripszin ellen kifejlesztett inhibitorok karakterizálásának irányítója Dr. Gráf László szenior kutató lesz, míg a MASP2 elleni inhibitor könyvtárak létrehozását és tesztelését Kocsis Andrea doktorandusz hallgató végzi majd.
Summary
In the scope of this proposal I aim to establish a directed evolutionary approach, phage display that I encountered while studying important protein-protein interactions at the Department of Protein Engineering of Genentech. This department pioneered the development of the phage display strategy in order to support systematic protein engineering studies, and many academic groups followed their trails later on. Phage display produces billions of protein or peptide variants and applies binding selections to yield sub-populations of functional clones. Statistical analysis of large number of such clones reveals what kind of amino acid sequences were selected with capacities to establish three-dimensional structures and dynamic properties that at the end provide the selected function. These clones represent information-rich source for individual biophysical measurements. Furthermore, phage display can generate peptide and protein variants that have new functions. Efficient ab initio design of such forms is still an unresolved problem.
I aim to reveal what structural requirements provide stable folding and characteristic specificity for certain protease inhibitors and how the stability of the corresponding protease-inhibitor complexes is established. I also aim to develop selective inhibitors against two human serine proteases, brain-specific human trypsin IV and a key enzyme of the complement system, the MASP2 protease. These two enzymes have no known canonic inhibitors. Dr. Laszlo Graf, senior participant scientist will direct the detailed analysis of the newly developed brain-specific human trypsin inhibitors, while Andrea Kocsis PhD student will construct and select inhibitor libraries on MASP2.




 

Final report

  
Results in Hungarian
Fő célom az volt, hogy meghonosítsam az irányított fehérjeevolúció szemléletét, és legsikeresebb technológiáját, a fágbemutatást. Egyrészt azt kutattuk, mi szabja meg a proteáz inhibitorok affinitását és specifitását. Három inhibitort vizsgáltunk: a kispeptid SFTI-t (Sunflower Trypsin Inhibitor), a kis fehérje SGPI-t (Schistocerca Gregaria Protease Inhibitor) és a homodimer Ecotint (E. Coli Trypsin Inhibitor). Másrészt inhibitorokat fejlesztettünk olyan humán proteázok ellen, amelyeknek nem volt ismert szelektív gátlószere. Mindhárom inhibitort sikerült evolválnunk. Feltártuk, hogy az SFTI mely csoportjai fontosak a molekula stabilitása és a proteázzal létesített specifikus kölcsönhatás szempontjából. Az SGPI családban feltártuk, hogy a hidrofób mag összetétele kihat a felszíni csoportokra és így a proteázzal alkotott komplex stabilitására. Egy rekord-felbontású SGPI variáns-tripszin komplex szerkezet által finomítottuk a szerin proteázok működési modelljét. Az Ecotint egyláncú formában fejeztük ki fágon, így a két monomer rész külön-külön evolválható lett. Szelektív inhibitorokat fejlesztettünk a hasnyálmirigy enzimek fő szabályzó proteáza, a kimotripszin C ellen, és a komplement rendszer lektin útjának MASP-1 és MASP-2 proteázai ellen. A MASP-gátlókkal létrehoztuk az első lektin út szelektív inhibitorokat, és korrigáltuk az útvonal-aktiválódás korábban hibásan leírt mechanizmusát. A projekt során 11 cikk, 3 szabadalom, 3 PhD dolgozat és tucatnyi tudományos díj született.
Results in English
A major project goal was to establish in Hungary the principle and technology of directed protein evolution. Via phage display I aimed to decipher fundamental rules governing affinity and specificity of protease inhibitors focusing on 3 inhibitors: the small peptide SFTI (Sunflower Trypsin Inhibitor), the small protein SGPI (Schistocerca Gregaria Trypsin Inhibitor) and the homodimer Ecotin (E. Coli Trypsin Inhibitor). I also aimed to evolve selective inhibitors against human proteases lacking such blockers. We identified SFTI residues providing inhibitor stability and those involved in specific protease-binding. In the SGPI family we revealed that the hydrophobic inhibitor core greatly affects the function of surface residues and thereby the stability of the protease-inhibitor complex. Based on an ultrahigh resolution SGPI variant – trypsin structure we refined the model of serine protease catalysis. We displayed Ecotin on phage in a single-chain format such that the two monomers could be evolved independently. We developed selective inhibitors against a major regulatory pancreatic protease, human chymotrypsin C. We also evolved mono-specific inhibitors against the lectin pathway complement proteases MASP-1 and MASP-2. With these we developed the first lectin pathway selective complement inhibitors and corrected the hitherto incorrect pathway activation model. Altogether 11 papers, 3 patents, 3 PhD thesis and a dozen scientific awards indicate the success of the project.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=68408
Decision
Yes





 

List of publications

  
Szenthe, B., Patthy, A., Gáspári, Z., Kékesi, A.K., Gráf, L., Pál, G.: When the Surface Tells What Lies Beneath: Combinatorial Phage-Display Mutagenesis Reveals Complex Networks of Surface–Core Interactions in the Pacifastin Inhibitor Family, Journal of Molecular Biology, 370, 63-69., 2007
Jakó, É., Ittzés, P., Szenes, Á., Kun, Á., Szathmary, E., and Pál, G.: In silico detection of tRNA sequence features characteristic to aminoacyl-tRNA synthetase class membership, Nucleic Acids Research, 35, 5593–5609, 2007
Gáspári, Z., Pál, G. and Perczel A.: A redesigned genetic code for selective labeling in protein NMR., BioEssays 30, 1-9., 2008
Gábor Pál, Sachdev S Sidhu: Mapping Protein Function by Combinatorial Mutagenesis, In: Ruth Nussinov, Gideon Schreiber (szerk.) Computational Protein-Protein Interactions. Boca Raton: CRC Press - Taylor and Frances Group, 2009. pp. 57-86., 2009
Gál Péter, Pál Gábor, Párisné Kocsis Andrea, Závodszky Péter: Új peptidek, eljárás elıállításukra és alkalmazásuk, Lajstromszám: P 0900319, 2009
Gál Péter, Pál Gábor, Párisné Kocsis Andrea, Závodszky Péter: Novel peptides, process for preparation thereof, and use thereof, lajstromszám: PCT/HU2010/00061, 2010
Gál Péter, Héja Dávid, Pál Gábor, Závodszky Péter: Új fehérjék, eljárás előállításukra és alkalmazásuk, lajstromszám: P1000366, 2010
Andrea Kocsis, Katalin A. Kékesi, Róbert Szász, Barbara M. Végh, Júlia Balczer, József Dobó, Péter Závodszky, Péter Gál, Gábor Pál: Selective inhibition of the lectin pathway of complement with phage display selected peptides against MASP-1 and -2: significant contribution of MASP-1 to lectin pathway, Journal of Immunology, 185, 4169-4178, 2010 Epub 2010 Sep 3., 2010
Wahlgren WY, Pál G, Kardos J, Porrogi P, Szenthe B, Patthy A, Gráf L, Katona G.: The catalytic aspartate is protonated in the Michaelis complex formed between trypsin and an in vitro evolved substrate-like inhibitor: a refined mechanism of serine prot, J. Biol. Chem. 286, 3587-3596, 2011
Szabó A, Héja D, Szakács D, Zboray K, Kékesi KA, Radisky ES, Sahin-Tóth M, Pál G.: High Affinity Small Protein Inhibitors of Human Chymotrypsin C (CTRC) Selected by Phage Display Reveal Unusual Preference for P4' Acidic Residues, J. Biol. Chem. 286, 22535-22545, 2011
Rapali, P., Radnai, L., Süveges, D., Harmat, V., Tölgyesi, F., Wahlgren, W.Y., Katona, G., Nyitray, L., Pál, G.: Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders interactors in the human proteome, PLoS One, 6, e18818, 2011
Rapali, P., Szenes, A., Radnai, L., Bakos, A., Pál, G., Nyitray L.: DYNLL/LC8: A Light Chain Subunit of the Dynein Motor Complex and Beyond, FEBS J., közlésre elfogadva, 2011
Áron Szenes, Gábor Pál: Mapping Hidden Potential Identity Elements by Computing the Average Discriminating Power of Individual tRNA Positions, DNA RESEARCH 19:(3) pp. 245-258., 2012
Dávid Héja, Andrea Kocsis, József Dobó, Katalin Szilágyi, Róbert Szász, Péter Závodszky, Gábor Pál and Péter Gál: Revised mechanism of complement lectin-pathway activation revealing the role of serine protease MASP-1 as the exclusive activator of MASP-2, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 109:(26) pp. 10498-10503., 2012
Heja D, Harmat V, Fodor K, Wilmanns M, Dobo J, Kekesi KA, Zavodszky P, Gal P and Pal G: Monospecific inhibitors show that both mannan-binding lectin-associated serine protease (MASP)-1 and -2 are essential for lectin pathway activation and reveal structural plasticity of MASP-2., JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 287: pp. 20290-20300., 2012



Back »