Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Participants
Balla, András
Starting date
2007-02-01
Closing date
2010-08-31
Funding (in million HUF)
31.500
FTE (full time equivalent)
2.19
state
closed project
Summary in Hungarian
Az inozitol lipidek ugyan csak kis hányadát teszik ki a membránokban található foszfolipideknek, mégis kiemelkedő szerepet játszanak szinte minden sejtfunkció szabályozásában. Kis mennyiségük, gyors metabolizmusuk, illetve kompartmentalizációjuk következtében vizsgálatuk nem sorolható az egyszerű feladatok közé. Az elmúlt években kutatásunk középpontjában olyan GFP-vel jelölt fehérje doménok alkalmazása állt, amelyek alkalmasak az inozitol lipidek kimutatására egyetlen élő sejtben. Ugyancsak részletesen foglalkoztunk a fehérjék különböző sejtorganellumok citoplazmatikus felszínére történő irányításával, illetve a rapamicin függő fehérje-fehérje interakciót kidolgozásával. Pályázatunkban ezeket az eszközöket szeretnénk felhasználni egy újfajta megközlítést biztosító molekuláris módszer kidolgozására. Ennek lényege az inozitol lipidek szintjének adott helyen való változtatása, lehetővé téve ezzel olyan alapvető biológiai folyamatok inozitol lipid szabályozásának tanulmányozását, mint például a receptor endocitózis. Számos, az endocitózisban szerepet játszó molekuláról ismert, hogy képes inozitol lipideket kötni, azonban ezek szabályozó szerepének jelentősége még messze nem tisztázott. Az inozitol lipidek szintjének adott régióban való változtatásával, illetve az endocitózisban részt vevő molekulák lipidkötő képességének befolyásával szeretnénk még alaposabban megérteni a transzferrin, az angiotenzin-II és az EGF receptor internalizáció lipid szabályozásának folyamatát. Reményeink szerint munkánk során sikerül olyan molekuláris kölcsönhatásokat is azonosítani, amelyek a receptorok internalizációjára ható, jövőbeli gyógyszerek támadáspontjául szolgálhatnak.
Summary
Phosphoinositides are minor components of membrane phospholipids with extraordinary importance in regulating virtually all cellular functions. In the plasma membrane they control processes that transmit and decode the changing environmental information into the cell interior. They are hard to study because of their small amounts, dynamic metabolism and cellular compartmentalization. My recent interest focused on the application of GFP-fused protein modules such as PH domains with specific inositide recognition to examine phosphoinositides in single living cells. Lately, I have been exploring the idea of targeting these domains to the cytosolic surface of specific membrane compartments and the possibility of inducing their translocation to those sites by using the rapamycin-induced heterodimerization of FKBP-12 and the FRB domain of mTOR. In the present application I am planning to apply these novel tools to develop new method in order to change the level of inositol lipids, and therefore to examine important biological questions such as the regulation of receptor endocytosis by phosphoinositides. Several molecules that participate in receptor endocytosis have been shown to possess binding to membrane phosphoinositides but the significance of their inositide-regulation is poorly understood. By manipulating inositide levels at specific locations and modifying the inositide binding properties of the participating proteins we want to determine the impact of these changes on the endocytosis of transferrin, angiotensin-II and EGF receptors. With these studies we expect to identify molecular events that could be targeted by future drugs for the control of receptor endocytosis.
Final report
Results in Hungarian
1. A plazmamembrán (PM) foszfatidilinozitol 4,5-biszfoszfát (PtdInsP2) szintjének csökkentésére kifejlesztett, rapamycin függő heterodimerizációs rendszer módosításával megoldottuk a transz-Golgi foszfatidilinozitol 4-foszfát mennyiségének akut csökkentését élő sejtekben, és ezzel megnyitottuk az utat e lipid kompartment jelentőségének vizsgálata előtt.
2. Létrehoztunk egy olyan fehérje készletet, amellyel az 5-15 nm-es tartományban, perces nagyságrendben mesterséges kapcsolat hozható létre a PM és az endoplazmás retikulum (ER), a mitokondrium és az ER, valamint a mitokondrium és a PM között. Más laborokkal együttműködve megállapítottuk, hogy a módszer jól alkalmazható olyan folyamatok vizsgálatára, amelyben az említett organellumok együttműködve vesznek részt (pl. kapacitatív Ca2+ beáramlás vagy mitokondriális Ca2+ jel kialakulása).
3. A PM receptorok endocitózisának molekuláris szintű vizsgálatára új, energiatranszfer mérésre épülő módszert fejlesztettünk ki. Megállapítottuk, hogy HEK293 sejtekben a Gq fehérjét aktiváló 1-es típusú angiotenzin II és a 2C típusú szerotonin receptor internalizációját alapvetően meghatározza a PM PtdInsP2 mennyisége. Kimutattuk, hogy a PtdInsP2 szint csökkentésével kiváltható gátló hatásért a klatrin burok lefűződésének elégtelensége tehető felelőssé, míg a receporok laterális mozgása és a klatrin burok területén történő bekoncentrálódása nem bizonyult PtdInsP2 érzékenynek.
4. Létrehoztunk egy sokoldalú, nagy érzékenységű fluoreszcens képalkotó rendszert.
Results in English
1. We developed a molecular tool suitable for the acute depletion of the trans-Golgi phosphatidylinositol 4-phosphate pool in live cells by modifying the rapamycin-dependent heterodimerization system. The main advantage of the system is that it allows further investigation of the role of this inositol lipid.
2. We created a protein tool useable for formation of an artificial bridge between organelles such as plasma membrane (PM) and endoplasmic reticulum (ER), mitochondrium and PM, mitochondrium and ER in the range of 5-15 nm in live cells. Collaborating with various laboratories we found the system suitable to investigate processes, in which the mentioned organelles worked in coorporation (e.g. store operated Ca2+ influx, mitochondrial Ca2+ signal).
3. Based on energy transfer measurements we developed a new method to follow the endocytosis of PM receptors at molecular level. We found that internalization of the Gq coupled type 1 angiotensin II recepors and type 2C serotonin receptors was highly determined by the PM PtdInsP2 content in HEK293 cells. We showed that the failure of the fission of clathrin coated pits were responsible for the inhibitory effect evoked by the decrease of PM PtdInsP2 concentration, while the lateral movement of the receptors, as well as their concentration in the clathrin coated membrane were not affected by the PtdInsP2 depletion.
4. We set up a versatile, highly sensitive digital image system suitable for single cell fluorescent measurements.
Varnai P, Toth B, Toth D, Hunyady L, Balla T.: Visualization and manipulation of plasma membrane-endoplasmic reticulum contact sites indicates the presence of additional molecular components within the STIM1-Orai1, Journal of Biological Chemistry, 282: 29678-29690, 2007
Péter Várnai, László Hunyady and Tamas Balla: STIM and Orai: the long-awaited constituents of store-operated calcium entry, TIPS, 30(3): 118-28, 2008
A. Balla, Y.J. Kim, P. Varnai, Z. Szentpetery, Z. Knight, K.M. Shokat, and T. Balla: Maintenance of Hormone-sensitive Phosphoinositide Pools in the Plasma Membrane Requires Phosphatidylinositol 4-Kinase III{alpha}, Mol Biol Cell, 19(2): 711-21, 2008
Varnai P, Balla T: Live cell imaging of phosphoinositides with expressed inositide binding protein domains, METHODS, 46: 167-176, 2008
Turu G, Varnai P, Gyombolai P, Szidonya L, Offertaler L, Bagdy G, Kunos G, Hunyady L: Paracrine transactivation of the CB1 cannabinoid receptor by AT1 angiotensin and other Gq/11 protein-coupled receptors, J BIOL CHEM, 284: 16914-16921, 2009
Balla T, Varnai P: Visualization of cellular phosphoinositide pools with gfp-fused protein-domains, Curr Protoc Cell Biol, Chapter 24: Unit 24.4.1-24.4.27, 2009
Dániel Tóth, László Hunyady, Tamas Balla and Péter Várnai: Investigation of the PtdIns(4,5)P2 Dependence of G Protein-Coupled Receptor Endocytosis in Living Cells, The 34th European Symposium on Hormones and Cell Regulation: “INOSITOL LIPIDS AND PHOSPHATES IN CELL SIGNALLING, METABOLISM AND DISEASES, Obernai, France, 2009
Szentpetery Z, Varnai P, Balla T.: Acute manipulation of Golgi phosphoinositides to assess their importance in cellular trafficking and signaling, PNAS, 107: 8225-8230, 2010
Csordas G, Varnai P, Golenar T, Roy S, Purkins G, Schneider TG, Balla T, Hajnoczky G: Imaging Interorganelle Contacts and Local Calcium Dynamics at the ER-Mitochondrial Interface, Molecular Cell, 39: 121-132, 2010
Hargitai D, Pataki A, Raffai G, Fuzi M, Danko T, Csernoch L, Varnai P, Szigeti GP, Zsembery A: Calcium entry is regulated by Zn(2+) in relation to extracellular ionic environment in human airway epithelial cells, RESPIR PHYSIOL NEUROBIOL, 170: 67-75, 2010
Enyedi B, Varnai P, Geiszt M: Redox state of the endoplasmic reticulum is controlled by Ero1L-alpha and intraluminal calcium, ANTIOXID REDOX SIGNAL, 13(6): 721-9, 2010
Tóth Dániel, Tóth József, Hunyady László, Várnai Péter: A plazmamembrán foszfatidilinozitol 4,5-biszfoszfát hatása az AT1 és 5HT2C receptorok internalizációjára emlős sejtben, A Magyar Élettani Társaság LXXIII. Vándorgyűlése, Szeged, 2010
