Molecular characterization of the circadian clockwork: Regulation of the expression of the oscillator protein on the transcriptional and posttranscriptional level
A cirkadián óramű molekuláris jellemzése: Az oszcillátor fehérje Frequency kifejeződésének transzkripciós és poszttranszkripciós szinten történő szabályozása
Title in English
Molecular characterization of the circadian clockwork: Regulation of the expression of the oscillator protein on the transcriptional and posttranscriptional level
Cell biology and molecular transport mechanisms (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Participants
Benyó, Balázs
Starting date
2007-07-01
Closing date
2011-10-31
Funding (in million HUF)
19.873
FTE (full time equivalent)
1.23
state
closed project
Summary in Hungarian
Az élettani, biokémiai folyamatok napszaki (cirkadián) oszcillációja szinte valamennyi élőlényre jellemző. Állatkísérletes és klinikai tanulmányok eredményei arra utalnak, hogy a cirkadián szabályozás zavara csökkenti a környezeti stresszhatások iránti toleranciát, és növeli számos betegség kialakulásának valószínűségét. A cirkadián óraművek meghatározó elemei transzkripciós faktorok és regulátor fehérjék, ezek egymáshoz kapcsolt visszacsatolási hurkokat képeznek. A ritmust szabályozó mechanizmusok igen konzerváltak. Mi modellorganizmusként a Neurospora crassa nevű gombát használjuk, amelyben a szabályozás két alapeleme a pozitív faktorként működő White Collar Complex (WCC) és a negatív elem Frequency (FRQ). A szabályozási hurok működési módjával kapcsolatban számos fontos kérdés tisztázatlan. Ezek megértése alapvető jelentőségű a cirkadián szabályozás zavarához kapcsolódó kóros állapotok megértése és kezelése szempontjából is. Kísérleti terveink három fő kérdéskör vizsgálatára irányulnak: I. A WCC által szabályozott promoter elemek karakterizálása – Célunk a WCC-t kötő, már kis számban karakterizált promoter szakaszokhoz hasonló szekvencia mintázatok keresése számítógépes programmal, és a talált szekvenciák szabályozási funkciójának kísérletes vizsgálata. II. Poszttranszlációs módosulás szerepe a WCC aktivitásának szabályozásában – Konkrétan a WCC foszforilációjának és az ezt befolyásoló protein foszfatáz 2A-nak a szerepét, illetve a WWC-szel való kölcsönhatását vizsgáljuk. III. A FRQ-expresszió poszttranszkripciós szabályozásának vizsgálata – A teljes frq RNS és a transzlációra kerülő RNS mennyiségének viszonyát és időbeli eloszlását vizsgáljuk.
Summary
Most organisms have developed ability to anticipate time in order to prepare their metabolism, physiology and behavior appropriately to the upcoming time of day. Both experimental data and clinical observations suggest that disturbances of the circadian system are coupled with increased incidence of cardiovascular, metabolic, psychiatric diseases and malignant tumours. The cellular mechanism of circadian control is highly conserved. Using the filamentous fungus Neurospora crassa as a model organism we aim to understand how the circadian clock coordinates complex expression profiles in a temporal fashion. On the molecular level hallmarks of circadian clocks are transcripition factors and regulatory proteins that constitute interlocked transcriptional and translational feedback loops. Two basic factors of the Neurospora clockwork are the positive element White Collar Complex (WCC) and the negative element Frequency (FRQ). In this project we concentrate on three major topics: I. Promoter elements controlled by the WCC – We aim to design a computer program searching the genome for sequence patterns similar to already characterized promoter parts regulated by the WCC. Found sequences will be experimentally tested. II. Role of posttranslational modification in the regulation of WCC activity – We plan to investigate the role of phosphorylation, influence of protein phosphatase 2A and its possible intraction with the WCC. III. Regulation of FRQ expression on a post-transcriptional level – We aim to analyze the temporal pattern of the actively transleted frq RNA fraction.
Final report
Results in Hungarian
Kutatási munkánk célja a cirkadián oszcillátor működését biztosító, illetve módosító faktorok megismerése és funkcionális jellemzése volt a Neurospora crassa modellorganizmusban. Eredményeink:
1. Létrehoztunk egy olyan számítógépes programot, amely a Neurospora crassa genomjában képes szekvencia-mintázatokat keresni. A cirkadián óra pozitív komponensének ismert kötőhelyeihez hasonló struktúrákat kerestünk és így azonosítottunk egy új, a cirkadián oszcillátor működését befolyásoló faktort, egy feltehetően RasGEF aktivitású fehérjét.
2. A cirkadián óra egyik pozitív komponensének, a White Collar-1 fehérjének a vizsgálata kapcsán azonosítottunk két, a fehérje foszforilációját és ezen keresztül működését alapvetően meghatározó fehérjerégiót. Az egyik régión belül szekvencia homológia alapján valószínűleg egy MAP kináz foszforilációs hely található.
3. Kimutattuk, hogy a VIVID nevű másodlagos fényreceptor a környezeti fényintenzitásra vonatkozó molekuláris memóriaként működik. A cirkadián óra pozitív faktorával kölcsönhatásba lépve gátolja annak fényfüggő aktiválódását és ezáltal természetes fényperiódusok mellett stabilizálja a cirkadián óra működését.
4. Eredményeink szerint a reaktív oxigén származékok (ROS) szintjének változása fontos tényezője a cirkadián óra szabályozásának. A ROS-szint a molekuláris oszcillátorra hat, emelkedése korábbra helyezi a fázist és rövidíti a periódust. A ROS szint változásának hatását valószínűleg a protein foszfatáz 2A közvetíti.
Results in English
Aim of our work was to functionally characterize factors involved in the regulation of the circadian clockwork of the model organism Neurospora crassa. Our most important results are summarized below:
1. We designed a computer program that enables one to search the genome of Neurospora for special sequence patterns. By searching for possible binding sites of the positive factor of the Neurospora clock we found a gene coding for a putative RasGEF protein. Our observations on a RasGEF mutant suggest that this protein is a modulator of the molecular clockwork.
2. We characterized two regulatory regions of the White Collar-1 protein. Deletion of these regions alters the phosphorylation of the protein and results in severe circadian phenotypes. One of these regions is a putative binding site of the MAP kinase.
3. We showed that the VIVID protein acting as a molecular memory interacts with and inhibits the positive component of the circadian clock and thus stabilizes the circadian rhythm even in naturally ambiguous photoperiods.
4. We found that reactive oxygen species (ROS) are important factors controlling the circadian clock. Increased ROS production advances the phase and shortens the circadian period. We suggest that the effect of ROS on the molecular oscillator is mediated by the protein phosphatase 2A.
Krisztina Káldi and Michael Brunner: Light dependent phosphorylation of clock components in Neurospora crassa, Gordon Konferencia, Chronobiology, 2007, 2007
Michael Brunner, Krisztina Káldi: Interlocked feedback loops of the circadian clock of Neurospora crassa, Mol Microbiol. 68(2):255-62, 2008
László Kozma-Bognár, Krisztina Káldi: Synchronization of the fungal and the plant circadian clock by light, Chembiochem. 9(16):2565-73, 2008
N Gyöngyösi, A P Sándor, K Kói, K Káldi: Contribution of ROS- and RASGEF-mediated signaling to the control of circadian rhythm in Neurospora crassa, EBRS Absztraktkönyv, 2009
Erik Malzahn, Stilianos Ciprianidis, Krisztina Káldi, Tobias Schafmeier, Michael Brunner: Photo-adaptation in Neurospora is mediated by competitive interaction of activating and inhibitory light-oxygen-voltage domains, Cell (in press), 2010
Gyöngyösi Norbert, Nagy Dóra, Káldi Krisztina: A szuperoxid anion szerepe a cirkadián óra működésében, Magyar Élettani Társaság Vándorgyűlésének Absztraktkönyve, 2011
