mitochondrion, protein kinases, substrate identification, apoptosis
Discipline
Cell biology and molecular transport mechanisms (Council of Medical and Biological Sciences)
80 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
20 %
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Dept. of Molecular Biology (Semmelweis University)
Participants
Horváth, V. Gábor Mészáros, Tamás Szarka, András
Starting date
2007-07-01
Closing date
2011-07-31
Funding (in million HUF)
22.315
FTE (full time equivalent)
5.43
state
closed project
Summary in Hungarian
A mitokondrium jelintegráló szerepe központi jelentőségű az anyagcsere folyamatok és a programozott sejthalál szabályozásában. Az utóbbi évek kutatásai nyilvánvalóvá tették, hogy a foszforilációs-defoszforilációs ciklus a mitokondriumban is fontos jelátviteli mechanizmus, ennek mikéntjéről azonban rendkívül kevés adat áll rendelkezésre. A növényi mitokondriumban lokalizált tíz fehérje kináz funkciója jelenleg teljes mértékben ismeretlen. Munkánk során az élesztő két hibrid rendszert kombináljuk egy specifikus fehérje foszforiláción és fehérje tömegspektrometrián alapuló szubsztrát azonosítási módszerrel. A két megközelítés ötvözésével hosszabb távon várhatóan a mitokondriális fehérje kinázok szubsztrátjainak döntő része azonosítható lesz, a pályázat ideje alatt azonban elsősorban egy MAP kinázt kívánunk tanulmányozni. Az emlős sejteken végzett kísérletek alapján ez a kináz szabályozhatja a citokróm C transzlokalizációját, így áttételesen a növényi apoptózist. Munkacsoportunk a szabályozó faktorok és szubsztrátok azonosítása mellett a MAP kináz mitokondriumra és citokróm C lokalizációra kifejtett hatását is vizsgálja különböző mitokondrium paraméterek mérésével. Az azonosított MAP kináz jelátviteli út in planta szerepét mutáns sejtvonalak, növények léthozásával, illetve a T-DNS inszerciós könyvtárból elérhető mutáns növények vizsgálatával kivitelezzük. A mitokondriális MAP kináz jelátviteli út tanulmányozása nagyban hozzájárulhat a növényi programozott sejthalál vagy apoptózis szabályozásának megértéséhez, az abiotikus és biotikus stresszhatásokra adott válaszok hátterének leírásához és ilyen módon gazdasági jelentőséggel is bír. Az IN 76674 beolvasztott pályázat összefoglalása(magyar): A mai ismereteink szerint, a mitokondrium nem egy egyszerű sejterőmű, funkciója sokkal szerteágazóbb, elengedhetetlen a sejtciklus, az apoptózis és az ionhomeosztázis szabályozásában, így a mitokondriális jelátvitel leírása több szempontból is fontos. A sejten belüli jelátviteli folyamatok központi eleme -a fehérjék foszforilációs-defoszforilációs ciklusa- a mitokondriumban is jelen van, ennek mikéntje és funkciója azonban ismeretlen. A genom szekvenciák elérhetősége és a tömegspektrometria fejlődése forradalmian megváltoztatta a fehérje kutatásokat. A tömegspektrométerek legújabb generációja a fehérje szekvencia meghatározásán túl már a fehérjék posztranszlációs módosításának tanulmányozására is alkalmas. A vázolt együttműködés a partnerek laboratóriumaiban elérhető speciális metodikák és műszerek kombinálásával kívánja leírni a növényi mitokondriális fehérje foszforilációs hálózatot, és ily módon feltárni annak funkcióját. A magyar kutatók sok éves tapasztalattal rendelkeznek a mitokondrium és fehérje kináz tanulmányok terén, valamint rutinszerűen állítanak elő fehérjéket in vitro körülmények között. Ezekhez a tapasztalatokhoz jól illeszkedve, az angol partnerek növényi proteom vizsgálatokat végeznek a legmodernebb tömegspektrométerek alkalmazásával. A leírt speciális metodikák és műszerek kombinációja elengedhetetlen a mitokondriális foszfoproteom sikeres tanulmányozásához, és várhatóan olyan új adatokat eredményeznek, amelyek hozzájárulnak a mitokondriális kinázok szerepének megértéséhez. A tudományos előnyök mellett, a kollaboráció hozzáférést biztosít a vezető növényi fehérje tömegspektrometriai laboratóriumok műszereihez, így kiváló lehetőséget nyújt a hallgatók és kutatók szakmai fejlődésére is.
Summary
Mitochondrion is a central signal integrator in regulation of metabolism and programmed cell death. Though it has been demonstrated that phosphorylation-dephosphorylation is important signalling mechanism in mitochondria, there is barely any data revealing the molecular details of mitochondrial kinase-phosphatase machineries. In plants ten kinases have been identified so far, but there is no available data describing their function. In order to reveal the substrates of mitochondrial kinases, the proposal suggests to combine yeast two hybrid system and a novel protein mass spectrometry based substrate identification protocol. Although we will focus on the mitochondria localised MAPK at the beginning, majority of the protein kinase substrates are expected to be identifiable by this protocol. One of the mammalian MAP kinases is known to translocalise into the mitochondria and to regulate the mitochondrial release of cytochrom C, the key molecule of apoptosis. Our research team will aim at finding the substrates of mitochondrial MAP kinase in Arabidopsis, and revealing the function of identified signal transduction pathway by measuring mitochondrion parameters and studying mutant plants. Description of plant mitochondrial MAP kinase signalling will aid the understanding of abiotic and biotic stress induced programmed cell death, hence, it also possess agricultural benefits. Az IN 76674 pályázat összefoglalása (angol): The protein studies have been revolutionized by availability of genome sequences and development of mass spectrometry. The state-of-the-art mass spectrometry instruments are capable for analysis of complex protein mixtures and determination of post-translational protein modifications. The protein phosphorylation-dephosphorylation cycle is central component of almost every intracellular signal transduction pathway, and recent publications indicate the existence of an intricate protein phosphorylation network in mitochondria, too. Detailed description of intramitochondrial signaling is crucial in many aspects since this organelle is not a simple power plant of cells, but it is also a cellular signal integrator which is responsible for apoptosis, cell division and ion homeostasis regulation. The proposed collaboration aims at depiction of plant mitochondrial phosphorelay network by combining cutting edge methodologies and instrumentation available in research partners’ laboratories. The Hungarian participants have extended knowledge of mitochondria analysis, kinase studies and protein production, while the English laboratories house state-of-the-art mass spectrometry instruments and have a considerable experience with plant proteome analysis. This amalgamation of special expertise is inevitable for analysis of plant mitochondrial phosphoproteome and expected to provide data that aid understanding the in vivo function of mitochondrial kinase network. Besides the scientific benefits, the collaboration will provide an access to leading plant proteome analysis laboratories providing unique training possibility, and help establishing a long term co-operation.
Final report
Results in Hungarian
Munkánk során a növényekre specifikus, kevésbé vizsgált, D típusú MAPKok családjának egyik tagját az AtMPK9-t tanulmányoztuk. Élesztő kettős-hibrid rendszerrel a kalmodulint, mint lehetséges AtMPK9 fehérje partnert azonosítottuk, majd a kölcsönhatást in vitro transzlációval előállított fehérjékkel többféle megközelítéssel igazoltuk.
Az AtMPK9 poszttranszlációs módosításokon keresztül történő szabályozása korábban ismeretlen volt. A pályázat keretében tömegspektrometriás vizsgálatokkal és in vitro mutagenezissel előállított AtMPK9 variánsokkal bizonyítottuk, hogy az aktiválásért felelős T hurok régióban elhelyezkedő TDY aminosav triplet treoninjának és tirozinjának foszforilálása nélkül a kináz nem rendelkezik aktivitással. A tömegspektrometriás adatok alapján az is nyilvánvaló vált, hogy az AtMPK9 kináz doménjét követő C-terminális doménben további négy aminosav foszforilálódik. Vizsgálataink szerint az összes általunk azonosított foszforiláció autofoszforiláció eredménye. Feltételezésünk szerint a kináz autofoszforilációs aktivitásának szabályozásában a kölcsönható partnerként azonosított kalmodulin kaphat szerepet.
Az AtMPK9 in planta funkcióját protoplaszt tranziens expresszióval és null-mutáns növényekkel tanulmányoztuk. Vizsgálataink alapján a fehérje kináz abiotikus stresszel aktiválható, azonban ennek ellenére a null-mutáns növények fenotípusa még stressz körülmények között sem tér el a vadtípusétól, így az AtMPK9 valószínűsíthetően funkcionálisan redudáns kináz.
Results in English
The project aimed at studying AtMPK9, a member of plant specific, D type mitogen activated protein kinase (MAPK). We identified calmodulin as its putative protein interacting partner by yeast two-hybrid assay. In order to evaluate this result, AtMPK9 and calmodulin were produced by in vitro translation and the interaction was confirmed by pull-down assays and surface plasmone resonance analysis.
The kinase activity regulation of AtMPK9 was unknown previously. We demonstrated by mass spectrometry and in vitro mutagenesis studies that phosphorylation of threonine and tyrosine of TDY amino acid triad of T loop is inevitable for kinase activity. Further mass spectrometry analysis revealed another four phosphorylated amino acids in the C-terminal domain of AtMPK9. According to our in vitro translation based data, all the identified phosphorylations are caused by autophosphorylation. We hypothesize that the interacting partner calmodulin regulates the autophosphorylation activity of kinase.
The in planta function of the protein kinase was studied by protoplast transient overexpression and application of AtMPK9 knock-out plants. Although the kinase activity of AtMPK9 was inducible by abiotic stress, the knock-out plants did not show any difference in phenotype, not even in stress conditions. These data imply that AtMPK9 is a functionally redundant protein kinase.
Sonkoly Boglárka, Horváth V Gábor, Mészáros Tamás: Mitogén aktivált fehérje kináz kölcsönható partnereinek vizsgálata fehérje in vitro transzlációval, 38. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2008., 2008
Zsigmond L, Rigó G, Szarka A, Székely G, Otvös K, Darula Z, Medzihradszky KF, Koncz C, Koncz Z, Szabados L.: Arabidopsis PPR40 connects abiotic stress responses to mitochondrial electron transportro transzlációval, Plant Physiology 2008 Apr;146(4):1721-37, 2008
Nagy Szilvia, Sonkoly Boglárka, Szeitner Zsuzsanna, Horváth V. Gábor, Mészáros Tamás: MAP kináz reguláció kalmodulinnal?, 40. Membrán-transzport konferencia, Sümeg, 2010
Sonkoly Boglárka, Bardóczy Viola, Mészáros Tamás: Expression and Purification of Active Protein Kinases from Wheat Germ Extracts, Methods in Molecular Biology, 2011;779:55-63 Plant Kinase Protocols, 2011
Zsigmond L, Tomasskovics B, Deák V, Rigó G, Szabados L, Bánhegyi G, Szarka A.: Enhanced activity of galactono-1,4-lactone dehydrogenase and ascorbate-glutathione cycle in mitochondria from complex III deficient Arabidopsis., Plant Physiol Biochem. 2011 Aug;49(8):809-15., 2011
