Importin-alpha2, nuclear protein import, ring canal, embryogenesis, Drosophila
Discipline
Cell genetics (Council of Medical and Biological Sciences)
70 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Institute of Genetics (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Participants
Szlanka, Tamás
Starting date
2007-07-01
Closing date
2010-07-31
Funding (in million HUF)
12.000
FTE (full time equivalent)
1.21
state
closed project
Summary in Hungarian
Az Importin-alfa (Karyoferin-alfa) fehérje mint a nukleáris lokalizációs szignált (NLS) kötő adapter, lényeges szerepet játszik a sejtmagi fehérje-importban Az elmúlt időszakban elsőként írtuk le az Importin-alfa2 (Imp-A2) sejtmagi importtól független citoplazmatikus funkcióit Drosophila melanogasterben (gyűrűcsatornák formálódása az oogenezis során, mitózis szabályozása a korai embriogenezisben) és azonosítottuk az Imp-A2 azon domain-jeit, amelyek lényegesek e funkciókban. További munkánk egyik célja a citoplazmás funkciók és az Imp-A2 domain-szerkezete közötti összefüggések analízise, elsősorban a foszforilációs helyek és a korai embrionális sejtosztódás szabályozásának szempontjából. Másrészt jellemezzük azokat a géneket ill. partner-fehérjéket, amelyek az Imp-A2-vel kapcsolatba lépnek genetikai interakció vagy molekuláris komplexképzés útján, és megvizsgáljuk szerepüket az Imp-A2 citoplazmás funkcióinak szempontjából. Ezek a kísérletek mélyebb bepillantást engednek az Imp-A2 hatásmechanizmusába a sejtmagi fehérje-import és a citoplazmatikus funkciók tekintetében. A munkát nemzetközi együttműködésben végezzük Dr. Bernard Mechler laboratóriumával (Német Rákkutató Központ, DKFZ, Heidelberg). Az együttműködés mindkét fél számára előnyös: a szegedi csoport nemzetközileg elismert Drosophila genetikusokból áll és minden feltétellel rendelkezik a tervezett genetikai és fejlődésbiológiai munkához, míg a Heidelberg-i csoportnak nagy tapasztalatai vannak a molekuláris biológia területén.
Summary
The Importin-alpha (Karyoferin-alpha) proteins are adapters which, by binding nuclear localization signal (NLS)-bearing cargo proteins to the Importin-b receptor, play an important role in the nuclear protein import. Previously, we were the first to describe the nuclear-import-independent cytoplasmic functions of Importin-alpha2 (Imp-A2) (ring canal formation in oogenesis, mitotic block in early embryogenesis), and identified the protein domains required for these functions. The further work will be aimed at the relationship between the cytoplasmic functions and the domain structure of Imp-A2, with special respect to the phosphorylation sites and the regulation of cell division in early embryogenesis. In addition, we will characterize the genes and the partner proteins which engage in genetic interaction or make a complex with Imp-A2, and will study their role in the above-mentioned cytoplasmic functions. These experiments will result in a deeper understanding of the mechanism of action of Imp-A2 both in the nuclear protein import and the cytoplasmic functions. The work will be done in collaboration with the laboratory of Dr. Bernard Mechler (German Cancer Research Center, DKFZ, Heidelberg). The cooperation is advantegous for both sides: the group of Szeged consists of internationally recognized Drosophila geneticists with all the conditions required for the planned developmental genetic work, while the group in Heidelberg is well experienced in molecular biology.
Final report
Results in Hungarian
Az importin-α2D14 + / + importin-βKetelRE34 Drosophila nőstényektől származó embriók letálisak. Jellemeztük a maternális interakciót. Főbb eredményeink:
- embrió letalitás a szinciciális blasztoderma állapotban a metafázisban blokkolt osztódási orsó hibái miatt. Konfokális mikroszkópiával jellemeztük a mutáns fenotípust.
- importin-α1, -α2, -α3 transzgének közül csak az i-α2 menekítette az embrió letalitást (paralóg-specifikus szerep)
- Importin-α2 (I-α2) fehérje az NLS-kötő domainjén keresztül köti az ISWI, CP190 és laminDm0 mitotikus faktorokat (ko-immunprecipitáció). Genetikai interakcióval azonosítottuk még a Rpl7 és Nup358 kölcsönható fehérjéket.
- DNS-szekvenálás: az importin-βKetelRE34 (RE34) egy D725N szuppresszor mutációt is hordoz.
- a RE34 mutáns fehérje nagyobb affinitással köti a RanGDP/GTP-t, mint a vad típus (GST pull-down). Számítógépes modellezés szerint ennek valószínű oka a RE34-nek a vad típusnál nyitottabb konformációja.
Modellünk: A Drosophila petében a mitótikus orsót felépítő fehérjéket NLS-szekvenciájuknál fogva az Importin-α2/ Importin-β komplex köti és tartja inaktív állapotban. A komplex RanGTP hatására szétesik, az orsófehérjék felszabadulnak, és megindul az osztódási orsók képződése. A maternális letalitás valószínű oka az, hogy az Importin-α2/ Importin-β KetelRE34 /NLS komplex a RE34 fokozott RanGTP kötése már alacsony RanGTP koncentrációnál szétesik, és a mitótikus fehérjék abnormális mennyiségben szabadulnak fel.
Results in English
importin-α2D14 + / + importin-βKetelRE34 heterozygous Drosophila females give rise to lethal embryos. We characterized this maternal interaction, the main results are as follow:
- the embryos die in the syncytial blastoderm stage because of abnormal mitotic spindles blocked in metaphase. We characterized the mutant phenotype by confocal microscopy.
- of the importin-α1, -α2, -α3 transgenes, only i-α2 rescued embryo lethality (paralog-specific role of i-2)
I-α2 protein binds the ISWI, CP190 and laminDm0 mitotic factors through its NLS-binding domain (co-immunoprecipitation). By genetic interaction, we identified the Rpl7 and Nup358 interactor proteins.
- DNA sequencing revealed a second-site D725N mutation in importin-β-KetelRE34 probably suppressing the dominant female sterile phenotype of KetelD.
- Importin-β-KetelRE34 protein (RE34) binds RanGDP/GTP with higher affinity than wild type (GST pull-down). It is likely explained by the more open than normal conformation of RE34 (computer modeling).
Our model: in the Drosophila egg the I-α2/ I-β complex binds inactive the mitotic proteins through their NLS sequences. RanGTP dissociates the complex liberating constituents of the mitotic spindle, and spindle formation begins. The maternal lethality of mutant embryos is likely caused by the higher than normal affinity to RanGTP of Importin-β liberating abnormal amounts of spindle proteins.
Virágh, E., Szlanka, T.,Török, I., Kallakuri,S., Kiss, I., Mechler, B.M.: The role of imp-alpha2 and imp-beta interaction in early mitotic divisions of Drosophila embryo, 21st European Drosophila Research Conference, Nice, Nov. 18-21, 2009, 2009
Virágh Erika, Szlanka Tamás,Török István, Sowyana Kallakuri, Kiss István, Bernard M. Mechler: Az importin-alpha2 mitózisban betöltött szerepének jellemzése az importin-béta génnel adott interakcióján keresztül Drosophila melanogasterben, VIII. Magyar Genetikai Kongresszus (Nyíregyháza, 2009.04.17-19.) Kongr. kiadvány, PG03, 2009
