Motor enzymology of DNA helicases  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
71915
Type K
Principal investigator Kovács, Mihály
Title in Hungarian DNS helikáz motorok enzimológiája
Title in English Motor enzymology of DNA helicases
Keywords in Hungarian biokémia, enzimológia, molekuláris motorok, DNS, helikáz, kinetika, fehérje
Keywords in English biochemistry, enzymology, molecular motors, DNA, helicase, kinetics, protein
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)50 %
Ortelius classification: Enzimology
Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)30 %
Ortelius classification: Molecular biophysics
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)20 %
Ortelius classification: Molecular design, de novo design
Panel Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent Department of Biochemistry (Eötvös Loránd University)
Participants Gyimesi, Máté
Starting date 2008-04-01
Closing date 2012-04-30
Funding (in million HUF) 24.670
FTE (full time equivalent) 4.09
state closed project
Summary in Hungarian
A kétszálú DNS szálainak szétválasztására sokféle életfolyamat során szükség van annak érdekében, hogy a molekula információ-tartalma hozzáférhetővé és változtathatóvá váljon. A szétválasztást minden élő sejtben helikáz enzimek végzik, amely “motorok” az ATP hidrolíziséből származó energiát hasznosítják a folyamat során. A projekt célja a RecQ családba tartozó DNS helikázok molekuláris működési mechanizmusának felderítése. Ezek az enzimek alapvető fontosságúak minden élőlényben (rendellenes működésük igen magas tumor prediszpozícióval jár), működési mechanizmusuk azonban ismeretlen. A helikáz aktivitás során történő molekuláris eseményeknek a korábbiaknál jóval nagyobb szerkezeti és időbeli felbontással történő vizsgálatához olyan biokémiai, tranziens enzimkinetikai és egyedi-molekula biofizikai arzenált fogunk alkalmazni, amely jórészt citoszkeletális motor enzimek vizsgálatában került kifejlesztésre. A klinikailag fontos humán BLM és az általános biológiai modellként szolgáló E. coli RecQ enzimek működését fogjuk vizsgálni. Spektroszkópiai és kinetikai kísérleteinkben helyspecifikus fluoreszcens jelzőcsoportokat alkalmazunk, amelyek a helikáz fehérjébe (egyedi triptopfánok), valamint az ATP illetve DNS szubsztrátok különböző pontjaira kerülnek beépítésre. Vizsgálni fogjuk a biológiailag releváns speciális DNS struktúrák helikázok által történő felbontását is, amely aktivitás számos életfolyamatban és betegségben kiemelkedő jelentőséggel bír.
Summary
In many life processes, the separation of the two strands of double-helical DNA is necessary in order to access and manipulate its information content. In all living cells, this activity is performed by motor enzymes called helicases that use ATP hydrolysis to fuel the unwinding reaction. The aim of this project is to elucidate the molecular mechanism of double-stranded DNA unwinding by RecQ-family helicases. These helicases are essential from bacteria to humans (their malfunctions cause high predisposition to cancer), but their mechanisms of action are unknown. To assess molecular events underlying helicase activity at a previously unattainable spatial and temporal resolution, we will utilise the highly sophisticated biochemical, transient enzyme kinetic and single-molecule biophysical methodical arsenal that has been pioneered in cytoskeletal motor enzyme research. We will elucidate the mechanism of action of BLM, a medically important human RecQ-family helicase and that of the E. coli RecQ enzyme, a general biological model. We will use various site-specific fluorescent reporters including single tryptophans engineered into the helicase enzymes at different key locations (ATP- and DNA-binding sites), fluorescent nucleotides and fluorescent DNA substrates. We will also determine how RecQ-family helicases unwind biologically relevant specific DNA structures.




 

Final report

  
Results in Hungarian
A projekt során a genom épségének fenntartásában központi szerepet játszó RecQ-családbeli DNS-helikázok közül az E. coli RecQ enzim és a humán Bloom-szindróma helikáz (BLM) működési mechanizmusát derítettük fel élvonalbeli gyorskinetikai, spektroszkópiai és egyedimolekula-biofizikai technikákkal. Kidolgoztunk egy analitikai eljárást, amelynek segítségével a nukleinsavak mentén haladó motorfehérjék legfontosabb működési jellemzői tranziens kinetikai kísérletsorozatokban meghatározhatók. Meghatároztuk és publikáltuk a RecQ és BLM helikázok egyszálú DNS-en történő transzlokációjának mechanizmusát. Meghatároztuk a BLM helikáz legfontosabb szerkezeti elemeinek szerepét a DNS-átalakító aktivitásokban, valamint leírtuk az enzim szubsztrát-indukált oligomerizációs mechanizmusát. A DNS-szálszétválasztás aktív duplex-destabilizációval megvalósuló mechanizmusát egyedimolekula-vizsgálatokkal derítettük fel. Leírtuk a RecQ helikázok más rekombinációs fehérjékkel történő együttműködésének számos új aspektusát.
Results in English
In this project we elucidated the mechanism of action of two RecQ-family DNA helicases (E. coli RecQ and human Bloom’s syndrome (BLM) helicases), which are essential players in maintaining the integrity of the genome. In this work we applied cutting-edge rapid transient kinetic and single molecule biophysical techniques. We developed an analytical method suitable for the determination of all key functional parameters of DNA-based motor enzymes. We elucidated the mechanism of translocation of RecQ and BLM helicases along single-stranded DNA. We identified the roles of the most important structural elements of BLM in the DNA-restructuring activities, and described the substrate-induced oligomerization mechanism of the enzyme. By using single molecule techniques we elucidated the physical mechanism of DNA strand separation that involves active destabilization of DNA duplexes. We also revealed several novel aspects of the cooperation of RecQ halicases with other proteins during homologous recombination processes.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=71915
Decision
Yes





 

List of publications

  
Máté Gyimesi, Kata Sarlós, Mihály Kovács: Working mechanism of the human Bloom’s syndrome helicase, Annual Meeting of the Biophysical Society, Boston, MA, USA, 2009
Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M.: Mechanism of translocation of the BLM helicase along DNA, Central-Eastern European INSTRUCT Meeting, Budapest, 2009
Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M.: Processive translocation mechanism of the human Bloom’s syndrome helicase along single-stranded DNA, EMBO Meeting on Helicases and Nucleic Acid Machines, Les Diablerets, Switzerland, 2009
Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M.: Mechanism of translocation of the BLM helicase along DNA, EMBO Young Investigator Meeting, Istanbul, Turkey, 2009
Sarlós, K., Gyimesi, M., Kovács, M.: Mechanism of DNA-dependent enzymatic activation of Escherichia coli RecQ helicase, EMBO Meeting on Helicases and Nucleic Acid Machines, Les Diablerets, Switzerland, 2009
Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M.: A humán Bloom szindróma helikáz processzív transzlokációs mechanizmusa, A Magyar Biokémiai Egyesület Vándorgyűlése, Budapest, 2009
Sarlós, K., Gyimesi, M., Kovács, M.: A DNS-függő enzimaktiváció szerepe a RecQ helikáz működésében, A Magyar Biokémiai Egyesület Vándorgyűlése, Budapest, 2009
Sarlós, K., Gyimesi, M., Kovács, M.: Mechanism of DNA-dependent enzymatic activation of Escherichia coli RecQ helicase, 54th Annual Meeting of the Biophysical Society, San Francisco, CA, USA, 2010
Gyimesi, M. Sarlós, K., Harami, G., Kocsis, Z., Kovács, M.: Deciphering the mechanochemistry of RecQ-family DNA helicases, EMBO DNA Repair Meeting, Brno, Czech Republic, 2010
Gyimesi, M., Sarlós, K., Derenyi, I., Kovács, M.: Streamlined determination of processive run length and mechanochemical coupling of nucleic acid motor activities, Nucleic Acids Research, 2010 Jan 31, 2010
Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M.: Processive translocation mechanism of the human Bloom’s syndrome helicase along single-stranded DNA, Nucleic Acids Research, 2010 Mar 8, 2010
Sarlós Kata, Gyimesi Máté, Kovács Mihály: Anyagmozgatás és információ-továbbítás a sejtben: biológiai motorok, Természet Világa 2009. május, 2009
Takács Balázs, Kovács Mihály: Motorok a sejtben - Mi hajt bennünket?, Élet és Tudomány, LXIV/6., 2009
Gyimesi Máté, Vellai Tibor, Kovács Mihály: A genetikai állomány stabilitása: helikáz enzimek szerepe a DNS-hibajavításban, Természet Világa, 2010. március, 2010
Gyimesi, M., Pires, R. H., Sarlós, K., Módos, K., Kellermayer, M. S., Kovács, M.: A szubsztrát-indukált oligomerizáció szerepe a humán Bloom-szindróma helikáz (BLM) működési mechanizmusában, Magyar Biokémiai Egyesület Vándorgyűlése, Budapest, 2010
Gyimesi, M., Sarlós, K., Kovács, M.: Two RecA domains comprise a minimal functional unit of the human BLM helicase, 55th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, MD, USA, 2011
Gyimesi, M., Harami, G. M., Sarlós, K., Hazai, E., Bikádi, Z., Kovács, M.: Complex activities of the human Bloom's syndrome helicase are encoded in a core region comprising the RecA and Zn-binding domains., Nucleic Acids Res. 2012 Jan 16 [Epub ahead of print], 2012
Sarlós, K., Gyimesi, M., Kovács, M.: RecQ helicase translocates along single-stranded DNA with a moderate processivity and tight mechanochemical coupling., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, in press, 2012




 

Events of the project

  
2010-08-19 09:58:20
Kiegészítő támogatás beolvasztása



Back »