Mycobacterium tuberculosis dUTPase as a tool in disease control: functional ablation, enzymatic mechanism and selective perturbation  Page description

Help  Print 
Back »
 

Details of project

  
Identifier
72008
Type PD
Principal investigator Tóth, Judit
Title in Hungarian A Mycobacterium tuberculosis dUTPáz enzimatikus mechanizmusa és szerepe a baktérium életképességében
Title in English Mycobacterium tuberculosis dUTPase as a tool in disease control: functional ablation, enzymatic mechanism and selective perturbation
Keywords in Hungarian dUTPáz, enzimkinetika, enzimatikus mechanizmus, génkiütés, antituberkulózis célpont
Keywords in English dUTPase, enzyme kinetics, enzymatic mechanism, functional ablation, antituberculotic drug target
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)50 %
Ortelius classification: Enzimology
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)30 %
Ortelius classification: Molecular biology
Biophysics (e.g. transport mechanisms, bioenergetics, fluorescence) (Council of Medical and Biological Sciences)20 %
Ortelius classification: Molecular biophysics
Panel Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent Institute of Molecular Life Sciences (Research Center of Natural Sciences)
Starting date 2008-09-01
Closing date 2012-08-31
Funding (in million HUF) 5.669
FTE (full time equivalent) 1.79
state closed project
Summary in Hungarian
A dUTPáz a dUTP pirofoszforolízisét katalizálja, és ezzel szabályozza a sejtekben az uracil DNS-be való beépülésének mértékét. A DNS-be épülő nagy mennyiségű uracil következménye sejthalál is lehet. Ezért nagy tudományos érdeklődésre tart számot a dUTPáz gátlásán alapuló új rákellenes, antivirális és antituberkulózis gyógymódok kutatása. Jelen pályázat fókuszában a Mycobacterium tuberculosis (MTB) dUTPáz áll, amelynek fiziológiás működése feltehetően élet-halál kérdés a baktérium számára a dTTP szintézisben betöltött központi szerepe miatt. A pályázat fő célkitűzései 1) a Mycobacterium túlélésének vizsgálata a dUTPáz működésének hiányában, 2) az MTB dUTPáz enzimatikus mechanizmusának felderítése különös tekintettel a humán (gazda) és MTB (patogén) enzimek közötti különbségekre, 3) az MTB és humán dUTPázokat leginkább megkülönböztető két szerkezeti elem, a C-terminális kar és a központi csatorna, katalízisben betöltött szerepének meghatározása. A fenti célok megvalósításához számos gyorskinetikai valamint egyensúlyi enzimológiai és spektroszkópiai módszert alkalmazunk vad típusú és helyspecifikusan módosított MTB dUTPáz enzimeken. A dUTPáz funkcióvesztés (feltehetően letális) hatását irányított géncserével történő génkiütéssel egy nem-patogén Mycobacterium modellben vizsgáljuk. A tervezett kísérletek egyértelműen felmérik az MTB dUTPáz, mint antituberkulózis célpont jelentőségét egy potenciális újgenerációs gyógymódban, és jelentősen hozzájárulnak a dUTPázok alapkutatásához.
Summary
dUTPase is the unique enzyme that catalyses the pyrophosphorolysis of dUTP, thus regulating the extent of uracil incorporation into DNA. Massive uracil incorporation may lead to cell death, dUTPase has therefore been recognized as a high-potential drug target in cancer, viral and bacterial disease control. The present proposal focuses on the Mycobacterium tuberculosis (MTB) dUTPase that also plays a central role in the mycobacterial dTTP biosynthesis and thus may be essential for the viability of MTB. The proposal has three specific aims all directed towards the evaluation of MTB dUTPase as a valid tool in fighting tuberculosis: 1) study the effect of dUTPase functional ablation on the viability of Mycobacterium, 2) elucidation of the enzymatic mechanism of MTB dUTPase with regards to the mechanistic differences between the human (host) and MTB (pathogen) dUTPases, 3) determine the catalytic role of the two structural elements that may be species-specifically targeted in dUTPase. To address the above issues, several transient kinetics and equilibrium enzymology as well as spectroscopy methods will be employed using wild-type and mutant MTB dUTPase enzymes. The physiological effect of dUTPase functional ablation will be investigated in a non-pathogenic Mycobacterium model subjected to dUTPase gene replacement. Besides the utility of this study in tuberculosis research, the expected result will also significantly contribute to the field of dUTPase enzymology.




 

Final report

  
Results in Hungarian
A jelen pályázatban megvalósult kutatást azzal a céllal végeztük, hogy átfogó alaptudományos tudásbázist teremtsen a dUTPáz tuberkulózis gyógyászatban történő jövőbeni felhasználásához. A folyamatban azonban az általános enzimműködés és enzimevolúció szempontjából is érdekes eredményeket kaptunk. Technológiai előrelépésként sikerült meghonosítani a tuberkulózis kórokozójának nem-fertőző modell rendszerét, amelynek eredményeképpen a Mycobacterium smegmatis genetikai manipulációját ma már rutinszerűen végezzük. Ebben kimutattuk, hogy az intakt dUTPáz jelenléte életfontosságú a mikobaktérium számára. Izgalmas felfedezésünk szerint egy eddig ismeretlen funkciójú, csak a mikobaktériumokra jellemző szerkezeti elem, és nem a dUTPáz enzimaktivitása felelős a dUTPáz létfontosságáért. Megmutattuk, hogy a dUTPázok több szempontból egyedi stratégiát alkalmaznak a nukleotid enzimatikus hidrolízisére. Többek között a nemszubsztrát dNDP és a szubsztrát dNTP megkülönböztetését kinetikai szelekcióval végzik egy P-loop-tól csak egy aminosavban eltérő motívum segítségével. Ugyanezen motívum dinamikájának vizsgálata világított rá egy teljesen új, „strip door”-nak keresztelt mechanizmusra, amely relatíve zárt aktívhelyre való ligandum kötést is lehetővé tesz. A dUTPáz szupercsaládba tartozó enzimek alegység-kölcsönhatásait vizsgálva arra a következtetésre jutottunk, hogy multimer enzimekben a kooperatív viselkedést a szabályozás szüksége hívja életre egy adott szerkezeti felépítményben.
Results in English
The present project has been carried out with the long-term aim of providing mechanistic knowledge to support the application of dUTPase-based strategies in fighting tuberculosis. While reaching our specific aims we came to discoveries concerning general principles of enzyme mechanism and evolution as well. As a technological development, we implemented a non-pathogenic model system of the tuberculosis pathogen and routinely use it for genetic manipulation. We showed in this Mycobacterium smegmatis strain that the intact dUTPase protein is indispensable for viability of mycobacteria. Interestingly, a mycobacterium-specific surface loop of yet unknown function and not the enzymatic activity itself is responsible for viability. We also showed that dUTPases apply unique strategies for the enzymatic hydrolysis of the nucleotide. For example, an unusual kinetic selection is used to discriminate the non-substrate dNDP from the substrate dNTP via a P-loop-like motif. Investigating the dynamic behavior of this same motif led to the proposition of a novel mechanism named “strip door” that allows for substrate binding to a relatively closed active site. We also investigated subunit interactions within the dUTPase superfamily and concluded that the cooperative behavior in multimeric enzymes is brought about by the necessity of feed-back regulation in a given structural architecture.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=72008
Decision
Yes





 

List of publications

  
Vértessy BG, Tóth J: Keeping uracil out of DNA: physiological role, structure and catalytic mechanism of dUTPases., Acc Chem Res 42, 97-106, 2009
Takács E, Nagy G, Leveles I, Harmat V, Lopata A, Tóth J and Vértessy BG: Direct contacts between conserved motifs of different subunits provide major contribution to active site organization in human and mycobacterial dUTPases, FEBS Lett 584, 3047-54, 2010
Pecsi I, Leveles I, Harmat V, Vertessy BG and Toth J: Aromatic stacking between nucleobase and enzyme promotes phosphate ester hydrolysis in dUTPase, Nucleic Acids Res, 2010 Jul 2. [Epub ahead of print], 2010
Pecsi I, Szabó J, Adams S, Simon I, Sellers JR, Vertessy BG, Toth J: Nucleotide pyrophosphatase employs a P-loop-like motif to enhance catalytic power and NDP/NTP discrimination, PNAS, 108, 14437-14442, 2011
Mészáros B, Toth J, Vertessy BG, Dosztanyi Z, Simon I: Proteins with Complex Architecture as Potential Targets for Drug Design: A Case Study of Mycobacterium tuberculosis., PLoS Comput Biol 7, e1002118, 2011
Erdélyi P, Borsos E, Takács-Vellai K, Kovács T, Kovács AL, Sigmond T, Hargitai B, Pásztor L, Sengupta T, Dengg M, Pécsi I, Tóth J, Nilsen H, Vértessy BG and Vellai T: Shared developmental roles and transcriptional control of autophagy and apoptosis in Caenorhabditis elegans, J Cell Sci 124, 1510-8., 2011
Merényi G, Kovári J, Tóth J, Takács E, Zagyva I, Erdei A and Vértessy BG: Cellular Response to Efficient dUTPase RNAi Silencing in Stable HeLa Cell Lines Perturbs Expression Levels of Genes Involved in Thymidylate Metabolism., Nucleos Nucleot Nucl 30, 369-90., 2011
Pecsi I, Hirmondo R, Brown AC, Lopata A, Parish T, Vertessy BG, Toth J: The enzyme dUTPase is required for mycobacterial viability, PLoS One. 2012;7(5):e37461, 2012
Kovacs E, Tóth J, Vértessy BG and Liliom K: Dissociation of calmodulin-target peptide complexes by the lipid mediator sphingosylphosphorylcholine: implications in calcium signaling., J Biol Chem 285, 1799-808., 2010
Kovacs E, Harmat V, Tóth J, Vértessy BG, Módos K, Kardos J and Liliom K: Structure and mechanism of calmodulin binding to a signaling sphingolipid reveal new aspects of lipid-protein interactions., FASEB J 24, 3829-39., 2010
Lopata Anna, Vértessy Beáta, Tóth Judit: dUTPáz, mint TBC gyógyszercélpont fajspecifikus szerkezeti elemeinek szerepe az enzimkatalízisben, A Magyar Biokémiai Egyesület folyóirata, XXXIII. ÉVFOLYAM 3. SZÁM 2009. augusztus, 2009
Takacs E, Vertessy BG and Toth J: Peculiar regulatory role of magnesium in the nucleotide hydrolysis of dUTPases, 54th Annual Meeting of the Biophysical Society, San Francisco, CA, USA, 2010
Pecsi I, Parish T, Brown AC, Vertessy BG, Toth J: Essentiality of dUTPase, a key enzyme in the thymidylate synthesis pathway in mycobacteria, The EMBO Meeting 2010, Barcelona, Spain, 2010
Szabó JE, Merényi G, Vértessy BG, Tóth J: Jósolható-e a kooperativitás a fehérjeszerkezet alapján?, A Magyar Biokémiai Egyesület 2010. évi Vándorgyűlése, Budapest, 2010
Hirmondo R, Pecsi I, Lopata A, Brown AC, Parish T, Vertessy BG and Tóth J: In vivo enzymology of dUTPase: enzyme kinetics combined with phenotype analysis of mutants in Mycobacterium smegmatis., The EMBO Meeting 2011, Vienna, Austria, 2011
Szabo JE, Takacs E, Merenyi G, Vertessy BG and Tóth J: Trade-off between cooperativity and specificity in the dUTPase superfamily., FEBS 3+ Meeting 2012, Opatija, Croatia, 2012
Róna G, Környei Z, Marfori M, Borsos M, Neubrandt M, Scheer I, Takács I, Tóth J, Babos B, Magyar A, Erdei A, Madarász M, Bozóky Z, Ellis JJ, Mehdi AM, Bodén M, Buday L, Kobe B and Vértessy BG: Oligomerization and cell-cycle dependent phosphorylation governs nuclear transport of dUTPases, FEBS 3+ Meeting 2012, Opatija, Croatia, 2012
Lopata A, Leveles I, Vértessy BG, Tóth J, Rosta E: Role of the c-terminal arm in the dUTPase catalytic mechanism., FEBS 3+ Meeting 2012, Opatija, Croatia, 2012
Toth J: The Mg ion regulates nucleotide hydrolysis in a novel way in dUTPase., FEBS 3+ Meeting 2012, Opatija, Croatia, 2012



Back »