ErbB proteins, protein association, trastuzumab, breast cancer, receptor-oriented therapy, resistance
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
70 %
Cancer and its biological basis (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Anticancer therapy
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Department of Biophysics and Cell Biology (University of Debrecen)
Participants
Szöllősi, János
Starting date
2008-09-01
Closing date
2012-09-30
Funding (in million HUF)
13.656
FTE (full time equivalent)
1.58
state
closed project
Summary in Hungarian
A sikeres daganatterápia kulcsa kevés mellékhatással rendelkező módszerek alkalmazása. Az ErbB2, amely a többi ErbB fehérje által mediált jelátvitel hatékonyságát fokozza, ilyen ígéretes terápiás célpont, hiszen egyes daganatok késői stádiumban is függenek expressziójától. A trastuzumab (Herceptin) egy ErbB2 ellenes, emlődaganatok kezelésére használt antitest, azonban a trastuzumab rezisztencia kialakulása jelenleg még elkerülhetetlen. Munkahipotézisünk szerint, melyet korábbi in vitro és xenograftokon végzett kísérleteink alapján állítottunk fel, a trastuzumab iránti érzékenységet az ErbB2 expressziós szintje mellett a vele kölcsönható fehérjék és immunszuppresszív citokinek határozzák meg. A jelen pályázat keretén belül a klinikai protokollnak megfelelően (tehát attól semmiben sem eltérően) trastuzumabbal kezelt betegekből származó szövet- és szérummintákat fogunk vizsgálni. A beteg trastuzumabra adott válaszát korreláltatni fogjuk emlő-specifikus differenciációs markerek expressziójával, az ErbB2 maszkírozásában részt vevő tényezők (MUC4, CD44, hialuronsav) mennyiségével, az ErbB2 foszforilációs szintjével és az ErbB2 fenti fehérjékkel alkotott asszociációival, továbbá az immunszuppresszív TGF-béta szérumszintjével. A vizsgálatokhoz elsősorban konfokális mikroszkópos immunfluoreszcens módszereket alkalmazunk. A fehérjék asszociációjának mértéket FRET módszerrel határozzuk meg. A várt eredmények hozzájárulhatnak a receptor orientált daganatterápia sikeresebb alkalmazásához.
Summary
The application of methods with few side-effects is pivotal to efficient cancer therapy. ErbB2 enhancing the signaling mediated by other ErbB proteins is such a promising target, since even late-stage cancers depend on its expression in certain cases. Trastuzumab (Herceptin) is an anti-ErbB2 antibody used in the treatment of breast cancer, but the development of trastuzumab resistance is currently inevitable. According to our working hypothesis based on our previous in vitro and xenograft experiments the interaction of ErbB2 with other proteins and the production of immunosuppressive cytokines determine trastuzumab sensitivity in addition to the accepted role of ErbB2 overexpression. In the framework of the current proposal we plan to investigate tissue and serum samples from patients treated according to established clinical protocols with trastuzumab. We will correlate the trastuzumab responsiveness of patients with the expression of breast-specific differentiation markers, the level of factors participating in masking of ErbB2 (MUC4, CD44, hyaluronan), the level of phosphorylation of ErbB2, the interaction of ErbB2 with the above proteins and with the serum level of TGF-beta, an immunosuppressive cytokine. We will primarily use confocal microscopic immunofluorescent approaches. Protein associations will be investigated with FRET methods. The expected results of the project will contribute to successful application of receptor-oriented cancer therapy.
Final report
Results in Hungarian
A trastuzumab rezisztencia és a hialuronsav expresszió közötti összefüggés igazolásához kifejlesztettünk egy olyan módszert, amely a sejtmembránban meghatározza az ErbB2-re normalizált trastuzumab mennyiségét és a környező hialuronsav denzitást. Humán emlőtumor mintákon igazoltuk, hogy a trastuzumab kötődése fordítottan arányos a hialuronsav pericelluláris mennyiségével. A szövetek hialuronidáz emésztése fokozta a trastuzumab kötődését, ami alátámasztja a maszkírozás jelenlétét.
Az elisidepsinről megállapítottuk, hogy a GPI-kötött fehérjék internalizációját váltja ki,és fokozza a sejtmembrán fluiditását és csökkenti a lipid molekulák hidratációját. Ezek alapján a gyógyszer elsődleges támadáspontja a membrán lipid tutaj komponense.
Kifejlesztettük a FRET-érzékenyített akceptor kiégetési technikát, amellyel lehetséges két fehérje egymással asszociáló arányának és a heteroklaszterek sztöchiometriájának meghatározása. Megállapítottuk, hogy stimulálatlan SKBR-3 sejtekben ErbB1 és ErbB2 aránya 1:1,5 volt a heteroklaszterekben, és ezt az EGF kezelés 1:4-re növelte.
„Number and brightness” méréseink alapján az ErbB1 stimulálatlan sejtekben elsősorban monomer állapotban van fiziológiás expressziós szintek esetében. EGF stimulációt követően, ill. jelentős overexpresszió jelenlétében EGF dimerek és a klatrin burkolt gödrökben ennél nagyobb klaszterek is vannak. Ezzel szemben az ErbB2 stimulálatlan sejteken nagyméretű klasztereket alkot, melyek mérete EGF stimuláció hatására csökken.
Results in English
In order to prove the relationship between trastuzumab resistance and hyaluronan expression we developed a method for determining the ErbB2-normalized binding of trastuzumab in the membrane and the hyaluronan density in the surrounding tissue. We showed on human breast cancer samples that trastuzumab binding is inversely related to pericellular hyaluronan density. Hyaluronidase digestion resulted in enhanced trastuzumab binding implying masking of ErbB2.
We showed that elisidepsin induces the internalization of GPI-anchored proteins, increases the fluidity of the cell membrane and decreases the hydration of lipid molecules. Based on these findings the primary target of elisidepsin is the lipid raft in the cell membrane.
We developed a method (FRET-sensitized acceptor bleaching) capable of reporting the fraction of proteins associating with each other and of determining the stoichiometry of heteroclusters. We showed that the ratio of ErbB1 and ErbB2 in their heteroclusters was 1:1.5 in quiescent SKBR-3 cells which was increased to 1:4 by EGF treatment.
Using number&brightness analysis we demonstrated that ErbB1 is present primarily as monomers in unstimulated cells at physiological expression levels. After EGF stimulation and in the presence of pathologic overexpression constitutive dimers and larger cluster are also present in clathrin-coated pits. To the contrary, ErbB2 forms large-scale associations in quiescent cells which are disassembled upon EGF stimulation.
