Az Escherichia coli mutációs folyamatai: analízis, átalakítás, alkalmazás
Title in English
Mechanisms of mutation in Escherichia coli: analysis, engineering and applications
Keywords in Hungarian
mutáció, mobilis genetikai elem, genom, DNS klónozás, fehérje és kismolekula túltermelés, biotechnológia, szintetikus biológia
Keywords in English
mutation, mobile genetic element, genome engineering, DNA cloning, protein and small molecule overproduction, biotechnology, synthetic biology
Discipline
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
35 %
Ortelius classification: Molecular biology
Microbiology: virology, bacteriology, parasitology, mycology (Council of Medical and Biological Sciences)
35 %
Molecular genetics, reverse genetics and RNAi (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Molecular genetics
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Biochemistry (HUN-REN Biological Research Centre Szeged)
Starting date
2008-04-01
Closing date
2011-04-30
Funding (in million HUF)
26.975
FTE (full time equivalent)
2.39
state
closed project
Summary in Hungarian
A pályázat keretein belül alapkutatási céllal kívánjuk vizsgálni a mutációs folyamatokat befolyásoló faktorokat Escherichia coli-ban. A laboratóriumunkban kifejlesztett E. coli MDS42 törzs e célra egyedülállóan alkalmas, mivel korábban eltávolítottunk belőle mindennemű mobilis genetikai elemet. A különböző IS elemeket tetszőleges kópiaszámban visszajuttatva a környezeti paraméterek függvényében mérhetjük azok transzpozíciós gyakoriságát. Ezzel párhuzamosan folytatni kívánjuk korábbi, a mutációs ráta további csökkentésével történő genom-stabilizációs munkánkat. A sokat hibázó, (error prone) DNS polimerázok génjeinek kiejtésével a pontmutációk, bizonyos exonukleázok túltermelésével pedig a deléciók gyakoriságát szeretnénk minimalizálni. Mindezekkel DNS klónozásra és/vagy fehérje túltermelésre optimalizált gazdasejtet kívánunk létrehozni, amely - ha sikerül bizonyítani előnyös voltát - akár 2-5 éves időtávlatban is leválthatja a jelenleg alkalmazott törzseket. Előzetes munkánk során már létrehoztunk javított laboratóriumi törzseket. A mutációs folyamatok jobb megértése révén további stabilizált genomú törzseket kívánunk létrehozni, mind egészségügyi, mind biotehchnológiai alkalmazásokra. E pályázat sikeres volta esetén hozzájárulna a 30-40 év közötti fiatal kutatók számának bővítéséhez az SZBK-ban. Fő kollaboránsom, Pósfai György csoportjában két fiatal PhD hallgató is bekapcsolódna e munkába, így e pályázat közvetve a PhD képzést is támogatná. Az elnyert pénzből a fogyóeszközök beszerzésén kívül egy új számítógépet és egy blottolásra is alkalmas poliakrilamid gél-elektroforézis rendszert is üzembe helyeznénk, mellyel szignifikánsan bővülne a rendelkezésre álló eszköztárunk.
Summary
In this study, we plan to investigate the factors influencing the rate and control of mutations in the genome of Escherichia coli. A unique tool, E. coli strain MDS42, engineered in our laboratory is readily available for this purpose. This strain lacks all mobile genetic elements, and thus allows the tight control of the type and copy number of such elements reintroduced on plasmids or on the genome. We also wish to study the changes in the mutation rate after deleting the genes of error-prone DNA-polymerases. Finally, we will attempt to decrease the rate of deletions forming in the genome and on plasmids by overexpressing the genes of certain exonucleases. The combinations of the above mentioned modifications will be tested in order to develop a strain with a lower overall mutation rate and thereby higher genetic stability. This strain could prove to be advantageous in DNA-cloning and protein overproduction purposes compared to present day host strains, and could serve as their replacement within a time scale of 2-5 years. Preliminary experiments conducted in this area have already yielded improved laboratory strains. Improving the understanding of basic mutational mechanisms can have practical benefits in applications related to health and biotech industry as well. This grant would widen the class of young investigators between the age of 30 and 40 in the BRC. Two PhD students, working on related topics under the supervision of my main collaborator, György Pósfai, would indirectly also benefit from the grant. Our working conditions will be improved by the installation of a polyacrlylamide-gel electrophoresis system equipped with blotting module, and a personal computer.
Final report
Results in Hungarian
A mutáció, azaz a DNS átörökíthető jellegű megváltozása nem csak emberben, de baktériumban is fontos jelenség, mind egészségügyi, mind biotechnológiai vonzata miatt. Az Escherichia coli baktérium mutációs gyakoriságát már korábban csökkentettük azáltal, hogy eltávolítottuk belőle az összes mobilis genetikai elemet, azaz „ugráló gént” (IS elemet, profágot, transzpozont). A jelen munkában bizonyítottuk, hogy az így kapott IS-mentes redukált coli törzs alkalmasabb olyan fehérjék túltermelésére, amelyeket egyébként a mobilis elemek túl gyakran inaktiválnának. Azért, hogy az IS-mentes coli törzset a törzs-szerkesztés során gyakran használt fág-transzdukció se szennyezhesse vissza IS elemekkel, létrehoztunk egy garantáltan IS-mentes P1 bakteriofágot. Az E. coli mutációs repertoárja további szűkítésének céljából eltávolítottuk az ún. „sokat hibázó” DNS polimerázok génjeit is. Ezzel a változtatással nagy részben kivédhetővé vált a baktériumokra stresszhelyzetek során jellemző mutációs gyakoriság-emelkedés is. Végül kifejlesztettünk egy módszert, amellyel mérhető, hogy egy IS-mentes törzshöz képest mekkora szelekciós előnnyel bír egy egyetlen kópia IS elemet tartalmazó baktérium. E rendszer segítségével újrajátszottuk azt az evolúciós folyamatot, mely során az első IS elemek elterjednek az enterobaktériumok genomjában, és megállapítottuk, hogy az IS elemek elterjedéséért azok „önző”, replikatív jellege, és nem az általuk okozott szelekciós előny tehető felelőssé.
Results in English
Spontaneous mutations arising in prokaryotes are the basis of several problematic phenomena, e.g. antibiotic resistance of pathogens or reduced production yield of various industrially useful bacterial strains. We have previously narrowed the mutational repertoire of Escherichia coli by removal of all mobile DNA elements (IS elements, prophages, transposons) in a large scale genome-reduction effort. In this work, we demonstrate that the lack of transposable elements aids the cloning and expression of a foreign protein, which is otherwise rapidly inactivated by ISes disrupting its gene with a high frequency. To prevent recontamination of the IS-free bacterial genome by transposable elements during generalized phage transduction, we have removed the resident IS1 element from the genome of phage P1vir, commonly used for strain engineering. We further decreased the mutation-generating potential of E. coli by removal of the genes of three error-prone DNA polymerases, thereby significantly reducing the rate of point mutations. In addition, we have developed a method to measure the selective advantage conferred by a single IS element residing in the bacterial genome, compared to an IS-free host. We used this technique to “replay evolution”, and demonstrate that the invasion of enterobacterial genomes by IS-elements in evolutionary history was most probably fueled by the selfish (replicative) nature of the elements, and not by the selective advantage they conferred to their hosts.
Fehér T, Karcagi I, Blattner FR, Pósfai Gy: Bacteriophage Recombineering in the Lytic State Using the Lambda Red Recombinases, Microbial Biotechnology (Közlésre elküldve), 2011
Fehér T, Bogos B, Méhi O, Fekete G, Csörgő B, Kovács K, Papp B, Pósfai Gy, Pál Cs: Evidence for competition between bacterial agents of evolvability, Mol Biol Evol (Közlésre elküldve), 2011
Fehér T: Systematic Reduction of Microbial Genomes, Nicholas Bergman: Microbial Systems Biology - New Directions and Opportunities. John Wiley and Sons, Weinheim, Németország (Közlésre elfogadva) ISBN: 978-0-470-40934-3, 2011
