General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Ortelius classification: Molecular biology
Panel
Molecular and Structural Biology and Biochemistry
Department or equivalent
Institute of Enzymology, BRC, Hungarian Academy of Sciences
Starting date
2009-01-01
Closing date
2011-12-31
Funding (in million HUF)
29.583
FTE (full time equivalent)
3.00
state
closed project
Summary in Hungarian
Jelen pályázatom a korábbi 73634 K kevés kritikát kapott és támogatandónak megítélt, de végül nem támogatott pályázat a kritikák figyelembevételével készült átdolgozott változata. Ennek megfelelően az átdolgozott változatot PD kategóriában nyújtom be és az FTE értéket 1-re állítottam be. Az ABC transzporterek széles körben elterjedt fehérjék, melyek élettani funkciója csak kevéssé ismert bár klinikai jelentőségük Mendeli betegségek és daganatos betegek drogrezisztenciájának kialaklulásában hatalmas. Jelen kutatási terv fő célkitűzése az ABC-transzporterek expressziójának metabolikus stresszek hatására bekövetkező megváltozásának vizsgálata. Kutatásainkat máj és bélhám eredetű in vitro sejtes modellrendszerekben kívánjuk végezni. Rövid és krónikus metabolikus stresszeknek (hypoxia, éheztetés, hyperlipidemia, stb) kitett sejtekben fogjuk vizsgálni az irodalmi adatok alapján kiválogatott ABC transzporterpanel (15 gén) expressziójának ingadozását. Előzetes kísérleteink azt mutatják, hogy egyes vizsgálni kívánt gének érzékenyek hipoxiára. Kísérletsorozatunk második szakaszában a metabolikus stresszekre legérzékenyebb gének szabályozási mechanizmusait próbáljuk meg felderíteni prómótereik analízisének segítségével. Kísérleteink során luciferáz riportergén esszét, valamint DNase hiperszenzibilitási esszét fogunk használni. Végezetül kromatinimunoprecipitáció segítségével tervezzük azonosítani a szabályozófehérjéket. Különösen a krónikus kezelések során kialakuló hosszútávú válaszok esetén tervezzük a DNS metilációs mintázat változásának vizsgálatát is. A szükséges metodológia nagyrésze rendelkezésre áll a laboratóriumban. Reményeink szerint ezek a vizsgálatok lehetővé teszik, hogy jobban megértsük az ABC-transzporterek ma még csak kevéssé ismert élettani szerepét különböző szövetekben, illetve részben a sejtdifferenciáció során. Kísérleteink klinikai vonatkozásai is jelentősek lehetnek, hiszen az ABC-transzportercsalád néhány tagjáról (ABCB1, ABCC1 és ABCG2) közismert, hogy jelentős szerepet játszanak a klinikai drogrezisztencia kialakulásásban, ami jelentősen befolyásolja a kemoterápiás kezelés és ezáltal a gyógykezelés sikerességét. Transzkripciós gátlásuk ennek fényében klinikai jelentőségűvé válhat.
Summary
The present grant proposal is the revised version of the previous 73634 K proposal, which was suggested by the committee to be financed but finally failed. According to the criticisms the new proposal is a PD application and the FTE value is set to 1. ABC transporters are widely expressed genes with mostly unknown physiological functions although their clinical importance in Mendelian diseases and the development of drug resistance in cancer patients is enormous. The main goal of the present grant proposal is the in vitro analysis of the regulation of human ABC transporter expression under various short term and chronic metabolic stresses (eg. hypoxia, starvation, hyperlipidemia, etc.). We propose to undertake the following specific aims: First, we will determine the effects of common metabolic stresses in hepatic and colon epithel cell lines on the expression of a panel of ABC transporter genes (15). Our preliminary experiments indicate the sensitivity of some transporter genes to hypoxia. Next, we will determine by luciferase and DNase mapping assays the transcriptional regulatory regions implicated in the stress answer of the most sensitive ABC genes (maximum 4) to the applied metabolic stimuli. In the last part of the present study we plan to identify the regulatory proteins and DNA methylation changes implicated in the short term and chronic stress answer. Most of the techniques needed are already available in the laboratory. These studies will contribute to the better understanding of the physiological role of the ABC transporters through the investigation of their transcriptional regulation. These studies may also acquire clinical importance if the development of drug resistance can be prevented by the downregulation of the expression of the implicated genes (ABCB1, ABCC1 and ABCG2).
Final report
Results in Hungarian
Legfontosabb eredményeinket az ABCC6 gén vizsgálata során értük el. A gén mutációi a pseudoxanthoma elasticum recesszív öröklődésű betegség kialakulásához vezetnek. Megerősítettük, hogy a mutáció hordozói 10x nagyobb kockázatnak vannak kitéve a coronaria arteriabetegség kialakulása tekintetében, mint a kontroll populáció.
Az ERK kaszkád aktiválódásának hatására májsejtekben megfigyelt ABCC6 expresszió-csökkenést vizsgálva
azonosítottunk egy HNF4 kötőhelyet;
igazoltuk, hogy az ERK1/2 aktiválása gátolja a HNF4 okozta ABCC6 expressziófokozódást;
beláttuk, hogy a HNF4 szükséges a további aktivátor faktorok hatásához és meghatározza az ABCC6 szövetspecifikus expresszióját.
Igazoltuk, hogy az ABCC6 gén első intronjában van egy sej- és főemlős-specifikus aktivátor szakasz, ami legalább két aktivátor fehérje kötőhelyet hordoz. Ezek egyike a C/EBP beta. Kimutattuk, hogy transzkripciós aktiváló hatásának kifejtéséhez szükség van a proximális promóterrel való együttműködésére, ami nem (közvetlenül) a HNF4 transzkripciós faktorral jön létre. Eredményeink azt sugallják, hogy az ABCC6 szerepet játszhat a hepatocyták metabolikus állapotának szabályozásában.
Terveztük az ABCC6 gén epigenetikai profiljának leírását is. Beállítottunk tehát egy LC/MS-MS módszert egyedi szekvenciák és teljes genom metiláció vizsgálatára. Igazoltuk, hogy a DNS metiláció egy dinamikus egyensúly eredménye, mely a sejtek osztódásától független folyamatos demetiláció és remetiláció eredménye.
Results in English
Our most important results were obtained on the ABCC6 gene. Mutations of ABCC6 lead to pseudoxanthoma elasticum, a recessive Mendelian disease. In our studies, we confirmed that mutation carriers have a 10x increased risk to develop coronary artery disease relative to controls.
While studying the regulation of the gene, we observed the decrease of the expression in hepatocytes upon the activation of ERK cascade. We showed that ERK activation inhibits ABCC6 expression via HNF4, which plays a crucial role in orchestrating the transcriptional regulation of the gene and regulation of its tissue-specific expression.
We also identified a primate and cell-type specific activator sequence in the 1st intron of ABCC6, which harbors at least two binding sites for activator proteins, one of which is C/EBP beta. We have shown that this activator region interacts with the proximal promoter but not directly with HNF4. Our data on the transcriptional regulation of ABCC6 suggest that ABCC6 reflect the metabolic state of hepatocytes and might play a role in influencing it.
We plan to investigate the epigenetic profile of the ABCC6 gene. We set up therefore a HPLC/MS-MS method to investigate the methylation of target sequences and genomes. We showed that in contrast to previous hypotheses global methylation level is a result of a dynamic equilibrium independent of replication but depending on permanent demethylation and remethylation.
Arányi T, Fülöp K, Symmons O, Pomozi V, Váradi A.: Predictable difficulty or difficulty to predict., Protein Sciences, 2011
Váradi A, Szabó Z, Pomozi V, de Boussac H, Fülöp K, Arányi T.: ABCC6 as a target in Pseudoxanthoma Elasticum., Curr Drug Targets, 2011
de Boussac H, Ratajewski M, Sachrajda I, Köblös G, Tordai A, Pulaski L, Buday L, Váradi A, Arányi T.: The ERK1/2-hepatocyte nuclear factor 4alpha axis regulates human ABCC6 gene expression in hepatocytes., J Biol Chem., 2010
