A Rho/Rac család GTPáz fehérjéire ható aktiváló proteinek kifejeződése és részvétele specifikus sejtműködésekben
Title in English
Expression and participation in specific cell functions of activating proteins acting on Rho/Rac family small GTPases
Keywords in Hungarian
kis GTPáz, GTPáz aktiváló fehérje, szöveti expresszió, neutrofil granulocita, sejtmozgás
Keywords in English
small GTPase, GTPase activating protein (GAP), tissue expression, neutrophilic granulocyte, cell motility
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
100 %
Panel
Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent
Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Participants
Csépányi-Kömi, Roland Hably, Csilla Lévay, Magdolna Lőrincz, Márton Ákos Timár, Csaba István
Starting date
2010-03-01
Closing date
2014-02-28
Funding (in million HUF)
26.026
FTE (full time equivalent)
6.38
state
closed project
Summary in Hungarian
A humán genom 70-80 fehérjét tartalmaz, amelyek a kis G-fehérjék Rho/Rac alcsaládjának tagjaira specifikus GTPáz aktiváló fehérjeként (GAP) működhetnek. Ezen fehérjék kifejeződési mintázata és élettani funkciói azonban kevéssé ismertek. A jelen pályázat fő célja a Rho/RacGAP fehérjék specifikus vagy átfedő funkcióinak valamint sejt-szintű szabályozásának vizsgálata. Ezt a célt az in silico kutatás valamint sejtvonalakon végzett csendesítési és túlkifejezési kísérletek kombinációjával kívánjuk megközelíteni. Elérhető adatbázisok analízisével összehasonlítjuk különböző szövetekben a Rho/RacGAP-ok kifejeződési mintázatát és ezzel meghatározzuk nyugvó és stimulált sejtek első “GAP-térkép”-ét. Az ARHGAP25 valamint néhány további Rho/RacGAP élettani funkcióját vizsgáljuk az általunk elkészített stabil PLB sejtvonalon, ahol az ARHGAP25 kifejeződését siRNS-el csökkentettük, másrészt COS-Phox sejtekben, amelyek kifejezik a fagocita oxidáz alegységeit és opszonin receptorokat, valamint az általunk transzfektált vadtípusú vagy mutáns Rho/RacGAP-okat. A közelmúltban kimutattuk, hogy a p190GAP szubsztrát specificitását savanyú foszfolipid felszín valamint PKC-mediált foszforiláció reverzibilisen változtatja. Ezen egyedülálló szabályozási mechanizmus élettani jelentőségét egér embrionális fibroblaszt, COS valamint COS-Phox sejteknek vadtípusú és mutáns p190GAP-al történő transzfekciója útján kívánjuk vizsgálni.
Summary
The human genome contains 70 to 80 proteins that may function as GTPase activating proteins (GAPs) acting on members of the Rho/Rac family of small GTPases. Data on the expression pattern and physiological functions of these proteins are scarce. The main goal of this project is to obtain insight into the specific or overlapping functions and cellular regulation of Rho/Rac family GAPs. We want to address these questions by a combination of in silico data mining with silencing and overexpression experiments carried out on cultured cell lines. By analysis of available databases we shall compare the expression pattern of Rho/RacGAPs in different tissues and prepare the first “GAP-map” of resting and stimulated cells. In order to pinpoint the function of ARHGAP25 and potentially of a few other Rho/RacGAPs in specific signaling pathways, we shall study stable PLB cells with down-regulated ARHGAP25 and “COS-Phox” cells (COS cells expressing the subunits of phagocytic oxidase plus opsonine receptors) transfected with wild-type or mutant Rho/RacGAPs. Our most recent results revealed that acidic phospholipids and PKC-mediated phosphorylation change the substrate preference of p190GAP between Rho and Rac. We shall investigate the physiological significance of this unique regulatory mechanism in mouse embryonic fibroblasts, COS and COS-Phox cells transfected with wild type or mutant p190GAP.
Final report
Results in Hungarian
A kutatási terv fő célkitűzése a kis G-fehérjék Rac/Rho családjára ható GTPáz aktiváló fehérjék (GAPok) szöveti eloszlásának, specifikus élettani hatásainak valamint szabályozásának vizsgálata volt. A pályázat munkatervében vállalt fő feladatokat teljesítettük. Nyilvánosan elérhető EST és mikroarray adatbázisok alapján elkészítettük a mintegy 30 szövetre vonatkozó első „GAP-térkép”-et. Ennek felhasználásával megklónoztuk az ARHGAP25 fehérjét, amelyről megállapítottuk, hogy elsősorban vérsejtekben fejeződik ki és mind in vitro, mind celluláris körülmények között kizárólag RacGAP aktivitással rendelkezik. A neutrofil granulociták modell sejtjeiben transzfekciós valamint csendesítési kísérletek alapján megállapítottuk, hogy az ARHGAP25 a fagocitózis negatív szabályozója. Izolált neutrofileken bemutattuk az ARHGAP25 dúsulását a fagoszóma körül és primer monocitákon alátámasztottuk a fagocitózis szabályozásáról sejtkultúrában nyert adatainkat. A Rac/RhoGAP molekulák specifikus hatásait keresve megállapítottuk, hogy a p50GAP ugyancsak rendelkezik sejtes körülmények között RacGAP hatással, de nem befolyásolja a fagocitózist. Granulocitákban elsőként írtunk le a RacGAPok közötti „munkamegosztást”. A p190GAP szabályozását vizsgálva megállapítottuk, hogy sejtes körülmények között is működik RacGAP-ként, és ebben a polibázikus régió kulcs szerepet játszik: hiányában megszűnik a RacGAP, viszont erősödik a RhoGAP aktivitás.
Results in English
The major aim of the research project was the examination of tissue distribution, specific physiological functions and regulation of GTPase activating proteins (GAPs) acting on the Rac/Rho family of small GTPases. We carried out all the major tasks summarized in the original research proposal. We compiled data available in public EST and microarray data bases and prepared the first „Rac/RhoGAP-map” of 30 different tissues. Using these in silico data we cloned ARHGAP25 and characterized it as a blood cell specific protein acting both in vitro and under cellular conditions exclusively as RacGAP. We carried out silencing and overexpression experiments in two different model cell lines of neutrophilic granulocytes and revealed ARHGAP25 as a negativ regulator of phagocytosis. In isolated neutrophils we demonstrated the enrichment of ARHGAP25 around the phagosomes and verified its effect on phagocytosis in primary monocytes. Investigating the specific or overlapping functions of RacGAPs in neutrophils we demonstrated that p50GAP had clear RacGAP effect, but did not affect phagocytosis. We thus provided the first example on specificity of RacGAPs in phagocytic functions. Studying the regulation of Rac/RhoGAPs, we demonstrated that p190GAP possesses RacGAP activity also under cellular conditions and the polybasic domain of the protein plays a key role: its absence suppresses the RacGAP, but enhances the RhoGAP activity.
Magdolna Lévay, Balázs Bartos, Erzsébet Ligeti: p190RhoGAP has cellular RacGAP activity regulated by a polybasic region, Cellular Signaling, 25. 1388-94, 2013
Timár CI, Lőrincz AM, Ligeti E.: Changing world of neutrophils., Pflugers Arch. 465. 1521-33., 2013
Lőrincz AM, Szarvas G, Smith SM, Ligeti E.: Role of Rac GTPase activating proteins in regulation of NADPH oxidase in human neutrophils., Free Radic Biol Med., 2014
Csépányi-Kömi Roland: Az ARHGAP25 - egy új GTPáz aktiváló fehérje - sejtélettani szerepének vizsgálata humán fagocitákban, Semmelweis Rgyetem Központi Könyvtára, 2013
R.Csépányi-Kömi, E.Lázár, G.Sirokmány, M.Geiszt and E. Ligeti: The possible role of ARHGAP25 in the phagocyte functions of neutrophilic granulocytes, Eur. J. Clin. Invest. 40. Suppl. 1., p37., 2010
R. Csépányi-Kömi, E. Lázár, J. Szabó, E. Wisniewski, G. Sirokmány, M. Geiszt, E. Ligeti: The novel Rac GTPase activating protein ARHGAP25 regulates phagocytosis in neutrophils, Eur. J. Clin. Invest. 41. Suppl. 1. p. 32., 2011
Erzsébet Ligeti, Stefan Welti, Klaus Scheffzek: Inhibition and termination of physiological responses by GTPase activating proteins, Physiological Reviews, 92. 237-272, 2012
Roland Csépányi-Kömi, Magdolna Lévay, Erzsébet Ligeti: Rho/RacGAPs: embarras de richesse?, Small GTPases - közlésre elfogadva, 2012
Grósz Veronika: Lehetséges neutrofil-granulocita-specifikus RhoGTPáz aktiváló proteinek keresése, Semmelweis Egyetem Élettani Intézet könyvtára, 2010
Lévay Magdolna Krisztina: A p190RhoGAP szabályozása foszfolipidekkel és foszforilációval, Semmelweis Egyetem Központi Könyvtára, 2010
Roland Csépányi-Kömi, Magdolna Lévay, Erzsébet Ligeti: Small G proteins and their regulators in cellular signalling, Mol. Cell. Endocrinol. 353. 10-20., 2012
Roland Csépányi-Kömi, Gábor Sirokmány, Miklos Geiszt, Erzsébet Ligeti: ARHGAP25, a novel Rac GTPase activating protein regulates phagocytosis in human neutrophilic granulocytes, Blood 119. 573-582., 2012
Erzsébet Ligeti, Roland Csépányi-Kömi, László Hunyady: Physiological mechanisms of signal termination in biological systems, Acta Physiol (Oxf) 204. 469-478., 2012
Timár CI, Lorincz AM, Csépányi-Kömi R, Vályi-Nagy A, Nagy G, Buzás EI, Iványi Z, Kittel A, Powell DW, McLeish KR, Ligeti E.: Antibacterial effect of microvesicles released from human neutrophilic granulocytes, Blood 121. 510-518., 2013
Roland Csépányi-Kömi1, Dávid Sáfár1, Veronika Grósz1, Zoltán László Tarján2, Erzsébet Ligeti1: In silico tissue-distribution of human Rho family GTPase activating proteins, Small GTPases, közlésre elfogadva, 2013
Magdolna Lévaya,b, Balázs Bartosa, Erzsébet Ligetia: p190RhoGAP has cellular RacGAP activity regulated by a polybasic region, Cellular Signaling, közlésre elfogadva, 2013
Roland Csépányi-Kömi, Magdolna Lévay, Erzsébet Ligeti: Rho/RacGAPs: embarras de richesse?, Small GTPases 3. 178-82., 2012
Roland Csépányi-Kömi1, Dávid Sáfár1, Veronika Grósz1, Zoltán László Tarján2, Erzsébet Ligeti1: In silico tissue-distribution of human Rho family GTPase activating proteins, Small GTPases, 4. 90-101., 2013
