Determination of the inhibitory mechanism for the P1 silencing suppressor of the Sweet potato mild mottle virus and characterization of its closest homologue, the P1 protein of the Sweet potato feathery mottle virus
A Sweet potato mild mottle virus P1 silencing szupresszor és legközelebbi rokona, a Sweet potato feathery mottle virus P1 fehérje pontos működési mechanizmusának meghatározása
Title in English
Determination of the inhibitory mechanism for the P1 silencing suppressor of the Sweet potato mild mottle virus and characterization of its closest homologue, the P1 protein of the Sweet potato feathery mottle virus
Horticulture (Council of Complex Environmental Sciences)
50 %
Ortelius classification: Gardening
Plant breeding (Council of Complex Environmental Sciences)
25 %
Crop protection (Council of Complex Environmental Sciences)
25 %
Ortelius classification: Crop protection
Panel
Complex agricultural sciences
Department or equivalent
Department of Dermatology and Allergology (University of Szeged)
Participants
Domokos, Klarissza Szabó, Edit Zsuzsanna
Starting date
2010-02-01
Closing date
2014-01-31
Funding (in million HUF)
23.694
FTE (full time equivalent)
1.82
state
closed project
Summary in Hungarian
Az RNS silencing egy olyan, a legtöbb eukariótában meglévő mechanizmus, ami képes a duplaszálú RNS-ek érzékelésére, és a megfelelő egyszálú RNS-ek szekvenciaspecifikus lebontására. Az RNS silencing lehetséges funkciója sokrétű, részt vesz a kromoszómák heterokromatikus régióinak kialakításában, a fejlődési program szabályozásában és antivirális szerepe is jelentős. A növényi virusok replikációjuk során hatékonyan indukálják az RNS silencing-et, azonban a vírusok RNS silencing szupresszoraik segítségével képesek a növényi antivirális válasz semlegesítésére. Korábbi munkáink során jellemeztünk több olyan silencing szuppresszort, ami az RNA induced silencing complex (RISC) kialakulását gátolja. Ezen szupresszor stratégia ellen az inverted repeat (IR) expresszáltatása hatékony antivirális védelmet nyújt. Ezzel szemben, a Sweet potato mild mottle vírus (SPMMV) P1 fehérjéje az eddig ismert egyetlen szupresszor, ami az aktív RISC mediálta RNS silencing-et gátolja. Tervezett munkánk során célul tűztük ki a P1 fehérje pontos működési mechanizmusának megismerését. Továbbá, szeretnénk az SPMMV P1 működését összehasonlítani, az egyetlen ismert homologjával, a Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) P1 fehérjéjével. Az aktív RISC-et gátló szupresszorok és a RISC felépülésért gátló (korábbi munkáink) szupresszorok működési mechanizmusnának ismeretében lehetővé válik olyan növények kialakítása, amelyek védettek lehetnek mindkét silencing szupresszor stratégiával szemben.
Summary
RNA silencing is a posttranscriptional sequence specific RNA degradation mechanism that serves as the major antiviral system in plants. Viral silencing suppressors were evolved to counteract with RNA silencing. RNA silencing could be inhibited at the level of RISC assembly and the level of the effector step (active RISC) by plant viral silencing suppressors. During our previous work, we found and characterized several viral silencing suppressors, which inhibit RISC assembly by sequestering viral siRNAs. Expression of an inverted repeat in the plant confers efficient protection against viruses having a suppressor strategy, which inhibits RISC assembly. However, our recent work shed the light on the silencing suppressor of the Sweet potato mild mottle virus (SPMMV), which inhibits active (assembled) RISC, but its exact inhibitory mechanism is not yet known. As a continuation of our work, we would like to characterize the P1 silencing suppressor protein of SPMMV and its only known homologue, the P1 protein of the Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) to understand their inhibitory mechanisms in depth. Together with our earlier results, the outcome of our project proposal will contribute to our understanding of the yet known plant viral silencing suppressor strategies. Thus based on this knowledge, we will be able to invent and test different strategies to amour crop plants against plant viruses having even any of the known silencing suppressor strategies.
Final report
Results in Hungarian
Az SPMMV P1 fehérjhe hatékonyan gátolja a si- és miRNS-sel töltött RISC komplexek aktivitását. Igazoltuk, hogy a P1 direkt módon kötődik az Argonaute 1 fehérjéhez. Megállapítottuk, hogy a P1 N-terminálisán lévő GW/WG dománek felelősek az AGO kötéséert és az aktivitásért. A P1 az első olyan GW/WG fehérje, amely negatívan szabályozza az RNS silencinget.
Izoláltuk és jellemeztük az SPFMV P1 fehérjéjét, ami az SPMMV P1 legközelebbi rokona. Eredményeink szerint az SPFMV P1 egy GW/WG domént tartalmaz és nem rendelkezik RSN silencing szupresszor aktivitással. Az SPFMV P1 fehérjeben helyreállítottuk a hiányzó GW/WG doméneket. Aktivitás vizsgálati eredményeink azt mutatták, hogy az SPFMV P1 az SPMMV P1-gyel közel azonos mértékben gátolta az RNS silencinget és a silencing szupresszor aktivitása az AGO kötő képességével korrelált. Jelenlegi ismereteink szerint, ez az első eset, amikor egy funkció nélküli virális fehérjéből in vitro mutagenezis segítségével egy RNS silencing szupresszor funkcióval rendelkező fehérjét alakítottak ki.
Érdekes módon az SPMMV P1 fehérjében találtunk egy cink finger domént. Mutációs analízisunk igazolta a cink finger domén jelenlétét a fehérjében és megállapítottuk, hogy a cink finger domén esszenciális az aktivitáshoz. A cink finger domén és az aktivitás szempontjából nagy fontossággal biro Trp 131 közötti távolság szigorúan szabályozott.
Végül meghatároztuk a legrövidebb működő P1 fehérjét, amitfunkcionális és szerkezeti vizsgálatokhoz használunk.
Results in English
We showed that the SPMMV P1 protein inhibits si/miRNA-loaded RISC through targeting AGO1. We confirmed that the interaction between P1 and small RNA loaded AGO1 is specific and direct. The suppression activity mapped to the N-terminal part of P1 containing three WG/GW motifs that resemble the AGO-binding linear peptide motif conserved in metazoans and plants. We proved that these three motifs are essential for both binding and suppression of AGO1 function. This is the first demonstration of a WG/GW protein having negative effect on RNA silencing.
We found that SPFMV P1, a close homologue of SPMMV P1, did not have any silencing suppressor activity. Remodeling the AGO binding domain of SPFMV P1 by the introduction of two additional GW/WG motifs converted it to a silencing suppressor with AGO binding capacity. To our knowledge, this is the first instance of the transformation of a viral protein of unknown function to a functional silencing suppressor.
Unexpectedly, we found a zinc finger domain in the P1 protein of SPMMV. Our results showed that the zinc finger domain is essential for the silencing suppressor activity. We found that a minimal spacing between the zinc finger and W131 residue is required for silencing suppressor activity of P1. We systemically truncated P1 protein from the C-terminal end and we got the shortest active version to be able to distinguish the binding function and silencing suppressor activity and for structural studies.
Giner A, Lakatos L, García-Chapa M, López-Moya JJ, Burgyán J.: Viral protein inhibits RISC activity by argonaute binding through conserved WG/GW motifs., PLoS Pathog. 2010 Jul 15;6(7):e1000996., 2010
Edit Z. Szabó, Máté Manczinger, Anikó Göblös, Lajos Kemény and Lóránt Lakatos: Switching on RNA Silencing Suppressor Activity by Restoring Argonaute Binding to a Viral Protein, J. Virol 86(15):8324, 2012
Edit Z. Szabó, Máté Manczinger, Anikó Göblös, Lajos Kemény and Lóránt Lakatos: Switching on RNA Silencing Suppressor Activity by Restoring Argonaute Binding to a Viral Protein., Journal of Virology, 2012
Lóránt Lakatos, Ana Giner, Meritxell García-Chapa, Juan José López-Moya, József Burgyán: Viral protein inhibits RISC activity by Argonaute binding through conserved WG/GW motifs., PLoS Pathog 6(7): e1000996. doi:10.1371/journal.ppat.1000996, 2010
