Cell differentiation, physiology and dynamics (Council of Medical and Biological Sciences)
90 %
Comparative physiology (Council of Medical and Biological Sciences)
10 %
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Department of Physiology (University of Debrecen)
Participants
Almássy, János Fülesdi, Béla Geyer, Nikolett Lukács, Balázs Sárközi, Sándor
Starting date
2010-06-01
Closing date
2014-12-31
Funding (in million HUF)
37.506
FTE (full time equivalent)
8.54
state
closed project
Summary in Hungarian
A malignus hiperthermia (MH) egy autoszomális domináns módon öröklődő betegség, melynek jellemző tünete, hogy bizonyos indukáló ágensekkel, így például koffeinnel, az altatószerként alkalmazott halothánnal, vagy 4-chloro-meta-cresollal a vázizom intracelluláris kalcium-homeosztázisának zavara váltható ki. Korábban kimutatták, hogy MH(+/+) egyedekben a RyR1 kalcium szenzitivitása abnormálisan és „féloldalasan” megváltozik, de senki sem vizsgálta, hogy más, alapvető modulátorok – mint pl. ATP vagy magnézium – befolyásolja-e a RyR1 működését MH-ban. Szintén tisztázatlan, hogy az MH mutáns RyR1 és a DHPR viszonya hogyan változik a vad típusú molekulák közötti kölcsönhatáshoz képest. A fentiek tisztázása céljából tervezzük az ATP és a Mg2+ modulációs hatását meghatározni kontrol és MH (A615C) mutáns sertésből származó minták felhasználásával, úgy, hogy a DHPR II-III hurokkal analóg skorpió-toxinok felhasználásával vizsgáljuk az ATP és a magnézium modulációs hatását. A vizsgálatokban alkalmazni kívánt technikák: mesterséges lipid kettősréteg membránba épített egyedi csatorna elektrofiziológiai vizsgálata, kalcium fluxus mérések metallokróm festékek felhasználásával és rapid filtrációval (radioaktív kalciummal). A „single channel” mérőrendszerben a membrán két oldalán – mérés közben – szabadon változtatható a médium összetétele, a kalcium fluxus mérések segítenek a bilayeres mérések verifikálásában és értelmezésében. A rapid filtrációs és a stop flow mérések a DHPR – RyR1 kölcsönhatás dinamikájának vizsgálatát teszik lehetővé.
Summary
Malignant hyperthermia (MH) is an autosomal dominant disorder characterized by abnormal calcium homeostasis in skeletal muscle in response to triggering agents, such as halothane, caffeine, 4-chloro-meta-cresol etc. As it has been shown previously the calcium sensitivity of the RyR1 altered in this disease, however no systematic study was carried out to investigate the effect of other vital modulators of the channel such as ATP and magnesium. It is also unclear, whether the interaction itself between the DHPR and the RyR1 changes in case of MH. We plan to clarify theses uncertainties such as to determine the ATP and Mg2+ modulation in control and MH (A615C) pigs and characterize the DHPR-RyR1 interactions using a wild type and a mutated scorpion toxin mimicking the II-III loop of the DHPR which in fact manifests the interaction between the two channels. We also plan to investigate whether the binding of these toxins will or will not alter the effect of MCa in the presence of ATP and magnesium. These studies will use single channel electrophysiology using artificial lipid bilayer, calcium flux measurements using metallochrome dyes and rapid flux measurements using radioactive isotope techniques. Single channel bilayer set-up allows to change the ionic composition of either side of the membrane, while calcium flux will be employed to verify and correlate the conductivity data. Rapid filtration and stop-flow measurement makes it possible to study the dynamics of the interaction between the DHPR and the RyR1.
Final report
Results in Hungarian
Az utolsó félévben egérre adaptáltuk a RyR1 preparációs technikát és optimalizáltuk hatásfokát. A kontrol (WT) állatok RyR1-ának gátlását határoztuk meg Sm ionnal, melynek ionátmérője a korábban vizsgálat lantanidák és a Ca ion közé esik (az ionátmérők sorrendje Ca > Sm > Eu > Gd). A WT RyR1 fél-gátló Sm koncentrációja 64.3 ± 2 nM volt a cis, míg 6.2 ± 0.1 microM volt a trans oldalon. A Hill koefficiens – a kötőhelyek száma – 2.2 ± 0.2 volt a cis és 4.7 ± 0.5 a trans oldalon. Az adatok azt mutatják, hogy a csatorna pórusa négy Ca kötőhellyel rendelkezik, ahova négy Gd, de csak két Sm, vagy két Eu vagy két Ca ion tud bekötődni – térszerkezeti okok miatt. Ez alapján a kötőhely magasságában a pórus átmérője legalább 3.79 Å, de legfeljebb 4.29 Å. A Sm és az Eu eltérő affinitása (64.3 nM versus 167 nM) a Ca kötőhely vonatkozásában arra utal, hogy a kétféle ion eltérő felületi töltéssűrűsége kissé eltérő módon torzítja a kötőhely töltésszerkezetét. A trans oldali Hill együtthatok mindkét lantanida esetén négy kötőhely jelenlétét valószínűsítik.
Results in English
In the extension period, we adopted of the RyR1 preparation procedures from rabbit to mice and managed to get reasonable yield. First we determined the single channel parameters of the control channels (with WT mice), using Sm ions, which is one step closer to the calcium than the previously used lanthanides (order of ionic radius Ca > Sm > Eu > Gd). By measuring Sm dependence of the open probability of RyR1 channels in WT mouse, we found, that the half inhibiting Sm concentration is 64.3 ± 2 nM on the cis while 6.2 ± 0.1 microM on the trans side. The Hill coefficients – the number of binding site – were 2.2 ± 0.2 on the cis, while 4.7 ± 0.5 on the trans side. Comparing these data to the data with other ions show, that there are four calcium binding sites are in the channel pore. We concluded, that at the cis side of the channel pore there are only two calcium binding site can be occupied by Ca, Sm and Eu but all four by Gd. The diameter of the channel pore at the modulatory Ca binding site is between 3.79 Å and 4.29 Å. Sm and Eu show different binding affinity (64.3 nM versus 167 nM), which reflects to the differences in the microenvironment due to the slightly different surface charge distribution of this two lanthanides.
The trans side data shows that the number of binding site is very similar for all of the lanthanides suggest, that the trans side binding sites are in the luminal vestibule. The Hill coefficients suggest about four binding site per channel.
Nagy M., Rácz D., Daróczy L., Lukács B., Jóna I., Zsuga M. és Kéki S.: Glükóz oldalláncokat tartalmazó poli(naftalén-fenilén) fényemittáló kopolimer előállítása és vizsgálata, Műanyag és Gumi, 48. 456-461., 2011
Almassy, J., Sarkozi, S., Jona, I.: Investigation of ryanodine receptor using peptide toxins, Acta Physiol Hung, 97. 89-89., 2010
János Almássy, Sándor Sárközi, IStván Jóna: Looking for the Calcium-Binding Site in the ryanodine receptor vestibule, Biophysical Journal, 106. 106a, 2014
