A gerincesek DNS-ében a citozinok egy jelentős része metilált (5-metilcitozin), és ez a módosult bázis 5’-CG dinukleotidokban található. A promoterek CG helyeinek metilálása más epigenetikus folyamatokkal társulva a gén kikapcsolását eredményezi. Az egyedfejlődés, a szövetspecifikus génműködés szabályozásának, valamint egyes betegségek patogenezisének megértéséhez nagyon fontos lenne, hogy a genomban meghatározott citozinokat szelektíven tudjunk metilálni és ennek biológiai hatását vizsgálhassuk. Ez elvben lehetséges úgy, hogy egy CG-specifikus DNS-metiltranszferázt (MTázt) egy szekvenciaspecifikus DNS-kötő fehérjével (cink-ujj fehérje, ZFP) fúzionáltatunk azzal a céllal, hogy a MTáz aktivitás a ZFP kötőhelyéhez közeli CG szekvenciákra korlátozódjon. A közölt próbálkozások nem kielégítőek, mert túl magas a háttérmetiláció és/vagy mert az alkalmazott MTáz specifitása (CCGG ill. GCGC) miatt a CG helyeknek elvben is csak kis hányada metilálható. Célunk olyan „programozható” MTázok létrehozása, amelyek képesek elvben bármely CG hely szelektív metilálására. Ennek érdekében egy CG-specifikus MTáz (M.SssI) felhasználásával két stratégiát javaslunk: 1) Olyan ZFP-M.SssI fúziókat hozunk létre, melyekben a MTáz partner a CG szekvenciához gyengén kötődő mutáns, ezáltal növelve a ZFP domén szerepét a specifitás meghatározásában. 2) Olyan M.SssI fragmentumokat szelektálunk, amelyek csak akkor tudnak aktív enzimmé összeállni, ha a hozzákapcsolt ZFP-domén révén a célhely szomszédságában megkötődnek. A tervezett módszerek a DNS-metiláció vizsgálatának széles körben felhasználható kísérleti eszközei és terápiás célú fejlesztés kiindulásai lehetnek.
Summary
In the DNA of vertebrates a significant fraction of the cytosines is methylated (5-methylcytosine), and this modified nucleobase is found in 5’-CG dinucleotides. Methylation of CG sites in promoters, accompanied with other epigenetic mechanisms, leads to gene silencing. To understand the regulation of ontogenesis, tissue-specific gene regulation and pathogenesis of some diseases it would be very important to be able to selectively methylate predetermined cytosines and study the biological effect. This, in principle, can be achieved by fusing a CG-specific DNA methyltransferase (MTase) to a sequence specific DNA binding protein (zinc finger protein, ZFP) thus limiting methylation activity to CGs located in the vicinity of the ZFP binding site. The published approaches are not satisfactory because of the high level of background methylation and/or because the specificity of the used MTase (CCGG and GCGC) allows methylation of only a small fraction of CG sites. Our goal is to construct „programmable” MTases, which, in principle, can methylate any CG site with high specificity. To this end, we propose two strategies built on the use of the CG-specific MTase M.SssI: 1) Construction of ZFP-M.SssI fusions, in which the MTase partner is a mutant enzyme with low binding affinity for CG sites allowing the ZFP domain to play the dominant role in determining methylation specificity. 2) Selection of M.SssI fragments, which can assemble to form active enzyme only when bound, via the fused ZFP domain, in the vicinity of the target site. The envisaged methods can become widely used laboratory tools in the study of DNA methylation, and can initiate research towards therapeutic application.
Final report
Results in Hungarian
Célunk az volt, hogy az irányított DNS metiláció módszerén javítsunk, specifikusabbá és egyszerűbbé tegyük. Az M.SssI bakteriális DNS metiltranszferázt (MTáz) használtuk, melynek specifitása (CG) megegyezik az emlős MTázokéval. Az irányított DNS metilációra javasolt egyik módszerben a MTázt cink-ujj fehérjéhez (ZF) fúzionálják, amely, mint irányító domén a kívánt DNS szekvenciához köti a MTázt, amely ezután elsősorban a közeli CG helyekkel reagál. Létrehoztunk egy kísérleti rendszert, amellyel ezt a módszert E. coliban vizsgálni és optimalizálni lehet. Plazmidokat készítettünk, amelyek a ZF-M.SssI fúziós gént és a targetrégiót hordozzák. Utóbbi tartalmazza a ZF kötőhelyet és néhány CG dinukleotidot. Az egyik közeli CG egy olyan restrikciós helyben van, amelyet, ha a CG metilált, az enzim nem tud hasítani. A metiláció specifitását restrikciós emésztéssel és biszulfitos szekvenálással analizáltuk. Vizsgáltuk, hogyan függ a metiláció specifitása a fúzió típusától, egyes M.SssI aminosavcseréktől, a ZF domén és a MTáz közötti ún. linker peptid hosszától, valamint a CG helynek a ZF kötőhelytől mért távolságától.
Kimutattuk, hogy az M.SssI több csonka, inaktív N-terminális fragmentuma képes csonka C-terminális fragmentumokkal aktív enzimmé összeállni. Kísérleteket kezdtünk arra, hogy ezt a jelenséget az irányított DNS metilációban kihasználjuk.
Kimutattuk, hogy az M.SssI képes a CG dinukleotidokban lévő citozint uracillá dezaminálni, míg az 5-metilcitozinnal nem reagál.
Results in English
Our goal was to make the available method of targeted DNA methylation more specific and simpler to use. We worked with the bacterial DNA methyltransferase (MTase) M.SssI, which shares the specificity of mammalian MTases (CG). In one of the approaches to targeted DNA methylation the MTase is fused to a zinc finger (ZF) protein, which acts as targeting domain binding the MTase to the sequence of interest leading to preferential methylation of closely located CG sites. We have developed an E. coli system, in which this method can be studied and optimized. Plasmids carrying the ZF-M.SssI fusion gene and the target region were constructed. The target region contains the ZF binding site and a few CG sites. One of the closely located CG sites is within the recognition site of a restriction enzyme, which cannot cut if the CG is methylated. Methylation specificity was studied by restriction digestion and bisulfite sequencing. We studied how the type of the fusion, amino acid substitutions in M.SssI, length of the linker peptide between the ZF and M.SssI, and the distance of the targeted CG from the ZF binding site affect specificity of targeted DNA methylation.
We have shown that truncated inactive N- and C-terminal fragments of M.SssI can assemble to form active enzyme. Experiments were started to exploit this phenomenon for targeted DNA methylation.
We have shown that M.SssI can deaminate cytosines in CGs to uracil, whereas deamination of 5-methylcytosine was not detected.
Stier, I. and Kiss, A.: Cytosine-to-uracil deamination by SssI DNA methyltransferase, 1st Hungarian Epigenetics Meeting, 20-21 September, 2012, Budapest, 2012
