Neurochemistry and neuropharmacology (Council of Medical and Biological Sciences)
70 %
General biochemistry and metabolism (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Metabolism
Panel
Neurosciences
Department or equivalent
Dept. of Medical Biochemistry (Semmelweis University)
Participants
Ambrus, Attila
Starting date
2011-01-01
Closing date
2014-07-31
Funding (in million HUF)
2.488
FTE (full time equivalent)
0.51
state
closed project
Summary in Hungarian
Az alfa-ketoglutarát-dehidrogenáz multienzim-komplex (KGDHc) a citrát-kör sebességmeghatározó enzime. A KGDHc-t a reaktív oxigénszármazékok (ROS, szuperoxid és hidrogén-peroxid) gátolják, miközben azok termelésére maga a KGDHc is képes. A KGDHc ROS által történő gátlása mitokondriális funkcióvesztéshez vezet, amely kritikus faktor számos betegség – többek között a neurodegeneráció – kialakulásában. A KGDHc patológiás viszonyok között felerősödő ROS-képzése irodalmi adatok alapján az E3 alegységen valósul meg, azonban legújabb eredményeink alapján a többi alegység részvételét sem lehet egyértelműen kizárni. Szándékunkban áll a nemzetközi együttműködés keretében megvizsgálni/feltárni a következőket: (a) a szerkezet-funkció összefüggését és a molekuláris mechanizmusokat, amelyek a KGDHc ROS-képzése komplex regulációjának hátterében állnak, (b) a ROS támadáspontjait a KGDHc-ben, (c) a KGDHc auto-inhibíciója mechanizmusát és (d) az amiloid-ß-peptid (Aß) kötőhelyét (az Aß szintén gátolja a KGDHc-t). A szerkezet-funkció összefüggés vizsgálata során kívánjuk szintén meghatározni az E1 és E2 alegységek eddig még nem ismert szerkezeteit röntgenkrisztallográfiával.
Summary
Alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHc) is rate-limiting in Krebs cycle and a target and generator of reactive oxygen species (ROS, superoxide and peroxide). Mitochondrial dysfunction due to inhibition by ROS of KGDHc is a critical factor in multiple diseases including neurodegeneration. The primary site for ROS production by KGDHc in pathological conditions appears to be the E3 component, but other hypotheses need exploring. We wish, in the form of the international collaboration, to (a) examine the structure-function relationship and the molecular mechanisms which are behind the complex regulation of ROS generation by KGDHc, (b) define the loci of ROS target sites in KGDHc, (c) elucidate the mechanism of self-inhibition of KGDHc, and (d) as the amyloid-ß-peptide (Aß) also inhibits KGDHc, to reveal its binding site. Examination of the structure-function relationship will involve the elucidation of the hitherto unknown structures of the E1 and E2 components by X-ray crystallography.
Final report
Results in Hungarian
3 hónapot töltött Ambrus Attila a Rutgers Egyetemen ezen OTKA pályázat támogatásával. Munkacsoportunk a humán alfa-ketoglutarát dehidrogenáz enzimkomplex (hKGDHc) E3 alegységével és annak reaktív oxigénszármazék (ROS)-termelő képességével foglalkozik. A Rutgers munkacsoportban számos más dehidrogenáz enzimkomplex E1 és E2 rekombináns alegységeihez is hozzáfértünk. Ily módon a teljes humán piruvát dehidrogenáz enzimkomplex (hPDHc) és a hKGDHc is rekonstitúcióval létrehozhatóvá vált. A Rutgers-csoportnak a komplexek E. coli verziói is rendelkezésre álltak így prokarióta/eukarióta különbségeket is vizsgálhattuk. Megállapítottuk, hogy: i., A PDHc molekuláris szinten ugyanolyan erős ROS-termelő, mint a KGDHc, ii., az E.coli komplexek szintén termelnek ROS-t, iii., a 4 komplex közül csak a hKGDHc E1 és E1-E2 alkomplexe képes ROS-t termelni, iv., az E3 G194C patológiás mutációja a hPDHc és a hKGDHc aktivitását is csökkenti és növeli a hKGDHc ROS-képzését a reverz reakcióban. Az E1-en történő ROS-képzés további vizsgálata során megállapítottuk, hogy: i., az E1-en α-KG hozzáadására stabil kation-gyök keletkezik, ii., különösen stabil dekarboxiláció utáni (első) átmeneti termék keletkezik (enamin), amelyet az α-KG C5-COOH stabilizál H-kötéssel, iii., az enamin reagál O2-nel szuperoxidot ill. kation gyököt képezve, iv., a reakció <1%-ban végbemenő párhuzamos mellékreakció, ami nem jelenik meg a teljes komplexben, orvosi jelentősége valószínüleg E2-deficiencia esetében várható.
Results in English
Attila Ambrus spent 3 months at Rutgers University using this OTKA grant. Our research focuses on the E3 component, and its reactive oxygen species (ROS) generation, of the human alpha-ketoglutarate dehydrogenase enzyme complex (hKGDHc). Rutgers possessed recombinant E1 and E2 components of various dehydrogenases, also E.coli versions, hence the human pyruvate dehydrogenase complex (hPDHc) as well as hKGDHc could be reconstituted and prokaryotic vs. eukaryotic complexes could also be investigated. We elucidated the followings: i., PDHc is as strong ROS producer as KGDHc on the molecular level, ii., the E. coli complexes also generate ROS, iii., from the 4 complexes investigated, the E1 and E1-E2 subcomplexes of only the hKGDHc produce ROS, iv., the G194C pathological mutant of E3 lowers the physiological activity of both hPDHc and hKGDHc and augments ROS generation by hKGDHc in the reverse reaction. On ROS generation by E1 (hKGDHc) we found that: i., α-KG generates a stable cation radical on E1, ii., a post-decarboxylation first intermediate with unusual stability was found (enamine) which is stabilized by the C5-COOH of α-KG via H-bonding, iii., the enamine reacts with O2 giving superoxide and the cation radical, iv., the reaction takes place in <1% relative to the main reaction pathway in parallel (off-pathway) and it does not manifest by hKGDHc; medical relevance might present in case of E2 deficiency.
