 |
Egy biomembránban működő molekuláris motor, a vakuoláris proton-ATPáz forgási mechanizmusa
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
101633 |
| típus |
K |
| Vezető kutató |
Páli Tibor László |
| magyar cím |
Egy biomembránban működő molekuláris motor, a vakuoláris proton-ATPáz forgási mechanizmusa |
| Angol cím |
The rotary mechanism of a molecular engine, the vacuolar proton-ATPase, working in a biomembrane |
| magyar kulcsszavak |
V-ATPáz, szerkezet-funkció kapcsolat, biomembrán, proton pumpálás, fizikai modell |
| angol kulcsszavak |
V-ATPase, structure-function relationship, biomembrane, proton pumping, physical modelling |
| megadott besorolás |
| Biofizika (pl. transzport-mechanizmusok, bioenergetika, fluoreszcencia) (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 50 % | | Ortelius tudományág: Molekuláris biofizika | | Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 30 % | | Ortelius tudományág: Molekuláris biológia | | Fizika (Műszaki és Természettudományok Kollégiuma) | 20 % | | Ortelius tudományág: Biomechanika |
|
| zsűri |
Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia |
| Kutatóhely |
Biofizikai Intézet (HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont) |
| résztvevők |
Ferencz Csilla Mária
Kóta Zoltán
Petrovszki Pál
Popescu Dorin-Mirel
Sebőkné Nagy Krisztina
Szalontai Balázs
|
| projekt kezdete |
2012-01-01 |
| projekt vége |
2016-12-31 |
| aktuális összeg (MFt) |
39.618 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
8.28 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A KUTATÁS ÖSSZEFOGLALÓJA, CÉLKITŰZÉSEK:
A projekt fő célja kidolgozni egy biomolekuláris, forgómozgást végző gépezet, a vakuoláris proton-ATPáz (V-ATPáz) forgó mechanizmusának fizikai modelljét. Annak érdekében, hogy a modell a funkció szempontjából releváns legyen, saját natív membránkörnyezetében lévő, működő V-ATPázon fogunk biofizikai méréseket végezni. Nemrégiben felfedeztük, hogy (az audio frekvenciás tartományban) oszcilláló (AC) transz-membrán potenciál rezonanciaszerűen befolyásolja a V-ATPáz ATP hidrolizáló aktivitását. Azért, hogy ezt a különleges jelenséget alaposabban megvizsgáljuk és adatokat gyűjtsünk a modellezéshez, a következő célokat tűzzük magunk elé:
Leellenőrizzük azt a hipotézisünket, miszerint a fenti jelenség az AC térnek a transz-membrán proton mozgásokra gyakorolt hatásából ered, és hogy az AC tér képes szinkronizálni az egyes V-ATPáz molekulákat.
Megmérjük az ATP hidrolízis és proton pumpálás közötti, a rotor forgása által közvetített csatolás mértékét (motor hatásfok).
Tesztelni fogjuk, hogy a motor vibrációi megjellennek-e a membránban tőle távolabb (motor zaj).
Megmérjük a forgást egyedi molekulákon, mégpedig AC tér jelenlétében (motor precizitás).
Meghatározzuk lipidek, gátlóanyagok, az AC tér jellemzőinek és egyéb fizikai feltételek hatását a V-ATPáz ATP hidrolizáló és proton pumpáló aktivitására, valamint a rotor, azaz a c alegység gyűrű forgására (motor vezérlés).
A KUTATÁSI PROBLÉMA ÉS AKTUALITÁSA:
Az alapvető kutatási kérdés, hogy ez a nagyon érdekes, összetett, sok alegységből álló biomolekuláris gépezet hogyan működik részleteiben. Hogyan szabályozható? Az ATP felhasználás, proton pumpálás és forgás sebessége szinkronban változnak-e? Milyen módon függ a gépezet működése a gátlóanyagoktól és a fizikai, kémiai feltételektől. A V-ATPáz nevű gépezet működését nem lehet teljesen megérteni a forgási mechanizmus részletes leírása nélkül. Ugyanakkor egy jobb fizikai modell jobb szövet- és családpecifikus V-ATPáz gátlóanyagokhoz vezet, igazolva a projekt kapcsolatát a rák, csontritkulás és gyomorsav túltengés betegségekkel.
A V-ATPázzal rokon F-ATPáz katalitikus doménje szerkezetének és alapműködésének megfejtése Nobel díjra vezetett, mert az intra-membrán fehérjék szerkezetének meghatározása nagyon nehéz, egész transz-membrán kötegekről nem is beszélve. A V-ATPáz esetében sem a 3 dimenziós szerkezetet, sem a működési mechanizmus részleteit nem ismerjük.
A fenti nehézségek miatt a membránfehérjék esetében nagyon megnőtt a funkcionálisan releváns szerkezeti adatok jelentősége. Ide kapcsolódik funkcionális szerkezetbiológiai megközelítésünk: eltérő típusú szerkezeti, kinetikai, dinamikai és termodinamikai adatokat gyűjtünk a működö célfehérjéről, amely adatokból modellt készítünk. A transz-membrán oszcilláló elektromos tér egy eszköz arra, hogy betekintést nyerjünk a motor működésébe, de lehetővé teszi azt is, hogy a hatása alatti ion-transzportáló membránfehérjék viselkedését leíró elméleti modelleket teszteljük.
A JAVASOLT KUTATÁS JELENTŐSÉGE ÉS ÚJSZERŰSÉGE:
A V-ATPáz az egyik legnagyobb kihívás a biofizikában napjainkban. Forgó mechanizmusa a kulcs az ATP hidrolízis és a transz-membrán proton szállítás kapcsolódásában. Egy aktív, de jövőre kifutó, teljesen OTKA által finanszírozott projektben felfedeztük, hogy trasz-membrán AC tér rezonanciaszerűen befolyásolja a V-ATPáz gépezet működését vakuoláris membrán vezikulákban. Éles rezonanciát látunk 88 Hz körül, ami kezdeti modellünk szerint a rotor 60 fokos elfordulásának felel meg. Ezzel legelső alkalommal, a célfehérje mindenféle módosítása nélkül sikerült meghatároznunk egy membránbeli pörgettyűs gépezet forgási sebességét natív membránban. Emiatt a kapcsolódó közleményt a Nature-be fogjuk beküldeni közlésre.
A várhatóan mások által is adaptálandó megközelítésünknek négy olyan eleme is van, ami azt a jelenlegi színvonal főlé helyezi, mert eddig sehol sem végeztek hasonló méréseket és mert a technika alkalmazható a natív környezetében lévő, működő V-ATPázon is: (i) Hamarosan képesek leszünk az ATP hidrolízis, a proton pumpálás és forgás szimultán mérésére. (ii) A valósidejű, digitális jelprocesszor, amely összekapcsolja majd mért AFM jeleket és az elektromosan vezető AFM tűre adott AC jelet, lehetővé teszi a motor közvetlen manipulálását és azt is, hogy észleljünk rezonanciákat és mechanikai mozgásokat, eddig nem tapasztalt precizitással. (iii) A dupla spektroszópiai berendezésben a rotor forgása modulálni fogja az EPR és fluoreszcencia spektrumokat. (iv) Nagy érzékenységű fluoreszcencia technikákkal pedig megcélozhatjuk a forgás detektálását egyetlen V-ATPáz molekulán is.
A KUTATÁS KÖZÉRTHETŐ ÖSSZEFOGLALÓJA:
A molekuláris gépek manapság a biofizikai kutatások frontvonalában szerepelnek. A V-ATPáz egy biomembránbeli motorfehérje, ami ATP-t használ és forgó mechanizmusa révén protont pumpál a membránon keresztül. OTKA által támogatott kutatásaink során nemrég felfedeztük, hogy audio frekvenciás váltóáramú tér, valószínűleg a protonok mozgását befolyásolva, rezonanciaszerűen hat a V-ATPáz aktivitására. Ezzel elsőként mértük meg a forgást egy működő biomembránban. Ezt az unikális módszert nagy felbontású spektroszkópiával és mikroszkópiával kombinálva a motor forgó mechanizmusát és mechanikai kölcsönhatásait fogjuk vizsgálni, és az alábbi kulcskérdéseket fogjuk megválaszolni:
Milyen hatásfokkal működik a motor, és a gerjesztés milyen paramétereivel lehet szabályozni a fordulatszámot és a működést? Tovaterjed-e a lipid kettősrétegben a motor mechanikai vibrációja (zaja)? Meg lehet-e forgatni a rotort, ha a motorból csak a tartókar van mellette. A projektben kidolgozzuk a V-ATPáz forgó mechanizmusának fizikai modelljét, ami hozzásegít a membránkötött bio-motorok jobb megismeréséhez. Új módszereinket valószínűleg nemzetközileg is adaptálni fogják ion-szállító membránfehérjék kutatásában. Várható eredményeink gyógyászati szempontból is fontosak, mert a V-ATPáz kulcsszerepet játszik olyan betegségekben, mint a rák, csontritkulás és a gyomorsav túltengés. Készítünk majd egy interaktív animációt is a biofizika iránt érdeklődők számára, amelyben láthatóak lesznek a motor különböző funkciói és hallhatjuk is a motort működés közben. | angol összefoglaló RESEARCH OBJECTIVES
The main goal of the project is to develop a physical model of the rotary mechanism of a biomolecular rotary engine, the vacuolar proton-ATPase (V-ATPase). To make the model functionally relevant, we aim biophysical experiments on functioning V-ATPase in its native membrane environment. We have recently discovered that an alternating (AC) trans-membrane electric field (oscillating in the audio frequency range) affects ATP hydrolysis by V-ATPase in a resonance like manner. In order to further explore this remarkable effect and gather data for the model, the following objectives are set:
Verify our hypothesis that the above phenomenon originates from the AC filed acting on trans-membrane proton movements, and that it synchronises individual V-ATPase molecules.
Measure the degree of coupling between ATP hydrolysis and proton pumping by the rotation of the rotor (engine efficiency).
Test wether the engine causes vibrations in the membrane (engine noise).
Measure the rotation rate directly in single molecules in the presence of an AC field (engine precision).
Determine the effect of lipids, inhibitors, characteristics of the AC field and other physical conditions on ATP hydrolysis and proton pumping activity of V-ATPase and the rotation of its rotor, the subunit c ring (engine control).
THE RESEARCH PROBLEM AND ITS TIMELINESS
The basic research problem is how this fascinating, complex, multi-subunit biomolecular engine is working in detail. How it is regulated? Do the rates of ATP consumption, acidification and rotation change in sync? How does the engine depend on inhibitors and physical, chemical conditions? Understanding the V-ATPase engine can not be complete without describing the rotary mechanism. A better physical model will lead to better tissue- and/or class-specific inhibitors of V-ATPases, which relate it to cancer, osteoporosis and acidosis.
Solving the catalytic domain (the easier one) of the related F-ATPase resulted in a Nobel prize, because it is extremely difficult to determine the structure of intra-membrane protein subunits, yet the whole assemblies. Neither a 3-dimensional structure nor details of the working mechanism of V-ATPase is known.
The significance of functionally relevant data on membrane proteins has greatly increased recently. Here fits in our functional structural biology approach: we gather various types of data on structure, kinetics, dynamics and thermodynamics on the functional target protein in its native environment, in order to build models. The trans-membrane AC field is tool for getting more insight into the engine, and it also allows testing recent theoretical models of ion-transporting membrane proteins in oscillating electric field.
THE SIGNIFICANCE AND INNOVATIVE NATURE OF THE PROPOSED RESEARCH
V-ATPase is a most challenging object of biophysical studies today. Its rotary mechanism is the key to couple ATP hydrolysis and proton translocation across the membrane. In a currently active, entirely OTKA funded grant (terminating next year), we discovered that a trans-membrane AC field influences the V-ATPase engine in a resonant like manner, in vacuolar membrane vesicles. A sharp resonance is seen at ~88 Hz, corresponding to a 60 degrees rotation of the rotor, according to the emerging model. For the very first time, we could determine the rotation rate of a membrane bound rotary engine in a native membrane, and without any attachment to or modification of the engine. For this reason, we will submit the corresponding paper to Nature.
Four aspects of our approach, likely to be adapted by other labs, put it beyond the state of the art because they have not been done before and they will be used on functioning V-ATPase in its native membrane: (i) We will very soon be able to measure the rates of ATP hydrolysis, acidification (proton pumping) and the rotation simultaneously. (ii) The real-time digital processing system connecting AFM signals and the AC signal on the conducting tip, will allow us exploring resonances, mechanical motions and direct manipulation of the engine, with un-precedented detail. (iii) We will use our double spectroscopic setup, in which the rotation of the rotor will modulate EPR and fluorescence spectra. (iv) With highly sensitive fluorescence techniques we can aim the direct detection of the rotation in single V-ATPase molecules. |
|
|
|
|
|
|
|
| |
Közleményjegyzék |
|
|
| Pali T, Szalontai B: Special issue: Membrane proteins-at the forefront of biophysical research, EUR BIOPHYS J 42: (2-3) 81-83, 2013 | | Kota, Z., Talmon, E., Kleinschmidt, J.H. and Pali, T.: Stability and unfolding of FomA, a β-barrel membrane protein, studied by fluorescence spectroscopy, Straub Days 2016, Biological Research Centre, May 25-26, 2016, 2016 | | Ferencz, Cs-M., Petrovszki, P., Der, A., Sebok-Nagy, K., Kota, Z. and Pali, T.: Oscillating electric field measures the rotation rate in a native rotary enzyme, Nature – Scientific Reports (accepted for publication), 2017 | | Szalontai B, Nagy G, Krumova S, Fodor E, Páli T, Taneva SG, Garab G, Peters J, Dér A: Hofmeister ions control protein dynamics, BBA-GEN SUBJECTS 1830: (10) 4564-4572, 2013 | | Csonka, C., Pali, T., Bencsik, P, Gorbe, A., Ferdinandy, P. and Csont, T.: Measurement of NO in biological samples, British Journal of Pharmacology 172(6), 1620-1632, 2015 | | Sebok-Nagy, K. and Pali, T.: P-type Pumps (ATP-ase), In: SZTE E-Learning, Molekuláris medicina, Transport, channel, membrane diseases, 3. Non-SLC transporters, 3.3. Pumps (ATP-ase), Secion 3.3.1., 2015 | | Pali, T.: V-type Pumps (ATP-ase), In: SZTE E-Learning, Molekuláris medicina, Transport, channel, membrane diseases, 3. Non-SLC transporters, 3.3. Pumps (ATP-ase), Secion 3.3.2, 2015 | | Sebok-Nagy, K. and Pali, T.: F-type Pumps (ATP-ase), In: SZTE E-Learning, Molekuláris medicina, Transport, channel, membrane diseases, 3. Non-SLC transporters, 3.3. Pumps (ATP-ase), Secion 3.3.3, 2015 | | Kota, Z. Talmon, E., Kleinschmidt, J.H. and Pali, T.: Stability and unfolding of FomA, a β-barrel membrane protein, studied by fluorescence spectroscopy, 16th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (ECSBM), Bochum, Germany, Szeptember 6-10., 2015, 2015 | | Pali, T. and Kota, Z.: Studying lipid-protein interactions with electron paramagnetic resonance spectroscopy of spin-labeled lipids., In: Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 974, Jorg H. Kleinschmidt (ed.), Springer, pp. 297-328., 2013 | | Marsh, D. and Pali, T.: Orientation and conformation of lipids in crystals of transmembrane proteins., European Biophysics Journal X, pp. X. DOI 10.1007/s00249-012-0816-6, 2013 | | Ferencz, C., Petrovszki, P., Kota, Z., Fodor-Ayaydin, E., Haracska, L., Bota, A., Varga, Z., Der, A., Marsh, D. and Pali, T.: Estimating the rotation rate in the vacuolar proton-ATPase in native yeast vacuolar membranes., European Biophysics Journal X, pp. X, DOI 10.1007/s00249-012-0871-z, 2013 | | Ferencz C, Petrovszki P, Kóta Z, Fodor-Ayaydin E, Haracska L, Bóta A, Varga Z, Dér A, Marsh D, Páli T: Estimating the rotation rate in the vacuolar proton-ATPase in native yeast vacuolar membranes, EUR BIOPHYS J 42: (2-3) 147-158, 2013 | | Marsh D, Pali T: Orientation and conformation of lipids in crystals of transmembrane proteins, EUR BIOPHYS J 42: (2-3) 119-146, 2013 | | Pali T, Kota Z: Studying lipid-protein interactions with electron paramagnetic resonance spectroscopy of spin-labeled lipids, In: Kleinschmidt Joerg H (szerk.) (szerk.) Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology Vol.974. Dordrecht: Springer, 2013. pp. 297-328., 2013 | | Pali T, Szalontai B: Special issue: Membrane proteins-at the forefront of biophysical research, EUR BIOPHYS J 42: (2-3) 81-83, 2013 | | Szalontai B, Nagy G, Krumova S, Fodor E, Páli T, Taneva SG, Garab G, Peters J, Dér A: Hofmeister ions control protein dynamics, BBA-GEN SUBJECTS 1830: (10) 4564-4572, 2013 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
