Állatorvos-tudományi Intézet (Agrártudományi Kutatóközpont)
projekt kezdete
2012-09-01
projekt vége
2014-05-31
aktuális összeg (MFt)
19.530
FTE (kutatóév egyenérték)
1.40
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Az 1980-as évek óta a sertések légzőszervi és szaporodásbiológiai tünetegyüttese (porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) becslések szerint évi több mint egymilliárd dolláros veszteséget okoz világszerte. A betegség kórokozója a PRRS vírus (PRRSV), az Arteriviridae családba tartozó pozitív szálú RNS-vírus, melynek két altípusa ismert, az Európából leírt 1-es és az Amerikából leírt 2-es típus. A PRRSV ellen eddig fejlesztett inaktivált illetve attenuált vírust tartalmazó vakcinák az eddigi jelentések szerint nem hatékonyak. Az inaktivált vírus vakcinák nem képesek megfelelő immunitást kialakítani, az attenuált vírus alapú vakcinák valamivel hatékonyabbak, de gyakran előfordul, hogy a legyengített vírustörzs visszanyeri patogenitását a vakcinázott állatokban. A sikertelenség egyik oka az, hogy a vírus RNS-függő RNS-polimeráza (RfRp) relatíve nagy mutációs rátával működik (azaz alacsony a megbízhatósága). Ez biztosítja a víruspopuláció számára az állandó változékonyságot (kvázispecies stratégia), ami önmagában is probléma az immunitás kialakításánál, valamint ez lehet a mutációkkal legyengített törzsek revertálódásának egyik oka is. Célunk ezért a vírus RfRp génjének tanulmányozása, az RfRp pontosságának mérése, valamint olyan RfRp törzsek létrehozása, melyek mutációs rátája legalább 1-2 nagyságrenddel alacsonyabb a vad típusénál.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Az elérendő célhoz először olyan vírusklónokat hozunk létre, melyek pontmutációval inaktivált zöld fluoreszcens fehérje (eGFP) transzgént tartalmaznak (eGFP PRRSV törzsek), majd megmérjük ezek reverziójának mértékét áramlási citometria segítségével. Kiindulási hipotézisünk, hogy a PRRS vírus RfRp pontossága alacsony (10 3 - 10-4 mutáció per nukleotid), ezért a vad típusú RfRp-t tartalmazó törzs esetében aránylag nagy mennyiségű revertáns eGFP-t fogunk kapni, melyek száma az RdRp mutagenezise után jelentősen csökkenhet. Az RfRp mutagenizációját több módszerrel kívánjuk elvégezni (random mutagenezis, más nagy megbízhatóságú RfRp mutánsokból ismert analóg helyek mutagenezise, valamint prediktált kaméleon szekvenciák mutagenezise). Várható eredményeink közt szerepel (i) egy fertőzőképes, és szövettenyészeten is jól szaporodó 1-es típusú (európai) PRRSV klón létrehozása; (ii) nukleotid szubsztitúciós pontmutációkat tartalmazó eGFP klónok sorozatának (eGFP0-PRRSV törzsek) létrehozása; (iii) a vad típusú RfRp mutációs rátájának meghatározása; (iv) nagy megbízhatóságú RfRp mutánsok izolálása, klónozása és (v) mutációs rátájuk meghatározása; (vi) az RfRp struktúra-funkció közti esetleges összefüggések felfedezése, ami távlati célként más, hasonló RNS-vírusok elleni védekezésben is felhasználható lenne; (vii) legalább egy olyan stabil, alacsony mutációs rátájú PRRSV törzs előállítása, amit vakcina fejlesztés alapjaként lehetne felhasználni.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Eredményeink az alapkutatás fontos kérdéseire adnak választ: (i) milyen szerkezeti okok állnak az RfRp nem megbízható működése mögött, (ii) mennyi a vad típusú RfRp mutációs rátája, (iii) mennyire tudjuk megnövelni az RfRp pontosságát. Egy általunk létrehozott alacsony mutációs rátájú RfRp-t tartalmazó PRRSV törzs alapul szolgálhat a legyengített vírust tartalmazó PRRSV-vakcinák fejlesztéséhez.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az 1980-as évek végén egy addig ismeretlen, légzőszervi és reprodukciós tünetekkel járó betegség tűnt fel az USA sertéstelepein, majd a rá következő években Európában és Kínában okozott járványokat. A sertések reproduktív és légzőszervi szindrómája (porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) súlyos, becslések szerint évi több mint egymilliárd dolláros veszteséget okoz világszerte. A betegség kórokozója a PRRS-vírus (PRRSV) – ugyanúgy, mint minden vírus – a fertőzés során bejuttatja örökítőanyagát a sertés különböző sejtjeibe, ahol szaporodni kezd, ezzel elpusztítja a megfertőzött sejteket, és súlyosan megbetegíti, akár el is pusztítja az állatot. Az eddig kifejlesztett oltóanyagok sikertelenek voltak a fertőzés megállításában. Ennek egyik oka a PRRSV-nek az a más RNS-vírusokra is jellemző sajátsága, hogy örökítőanyagát nagyon pontatlanul másolja, ezáltal rengeteg mutációt halmoz fel, amelyek elősegítik a vírus nagyon gyors változását. Ez a változékonyságra való hajlam komoly problémát okoz a vakcina fejlesztésnél is. Az oltóanyagokban található legyengített vírusok gyors mutációs képességük miatt gyakran erős, virulens vírussá változnak vissza a beoltott állatban, és ezáltal maga az oltás okoz betegséget. Kutatásaink arra irányulnak, hogy a vírus mutációs képességét lecsökkentsük, ezáltal olyan védőoltás kifejlesztése váljon lehetővé, ami nem képes virulens vírussá visszaváltozni. Reményeink szerint kutatásaink eredményét a későbbiekben más RNS-vírusok elleni védekezésben is hasznosítani lehet majd.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) causes an estimated loss of more than $1 billion per year worldwide since the 1980s. The causative agent of the syndrome is the PRRS virus (PRRSV), a positive strand RNA virus belonging to the Arteriviridae family. There are two known genotypes of the virus, type 1 PRRSV described from Europe and type 2 PRRSV described from America.
Up to the present, none of the commercially available inactivated or modified live vaccines (MLV) are efficacious. The inactivated vaccines are unable to establish an appropriate and reproducible immunity, while MLVs can be more efficacious but often revert into pathogenic strains. One of the reasons of the failure is that the fidelity of RNA dependent RNA polymerase (RdRp) of the virus is low (meaning high mutation rates). It ensures that the viral population has a high variability (quasispecies strategy) which is a problem for immunization in itself, and it may cause MLV to revert into pathogenic strains.
Our objective is to study the RdRp gene of the virus, to measure its fidelity and to develop PRRSV strains with a 10-100 times higher fidelity RdRp.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. At first PRRSV clones will be created with loss-of-function base substitution mutant versions of enhanced green fluorescent protein (eGFP) transgene inserted into the viral genome (eGFP PRRSV strains). The reversion of the mutant eGFP into normal eGFP will be measured using fluorescence-activated cell sorting. Our null hypothesis is that the fidelity of PRRSV RdRp is low (10-3 - 10-4 mutation per nucleotide), so relatively high amount of revertant virus will be observed in wild type viral stocks which amount will be significantly lower in certain RdRp mutant viral stocks. RdRp mutagenesis is proposed to be executed using different approaches, such as: random mutagenesis, mutagenesis of analogous sites of other known high fidelity RdRps and mutagenesis of predicted chameleon sequences. Our expected results are: (i) an infective clone of type 1 PRRSV and (ii) a set of loss of function nucleotide substitution mutant eGFP-PRRSV strains (termed as eGFP0 PRRSV) will be obtained; (iii) mutation rate of wild type RdRp will be measured; (iv) high fidelity RdRp mutant strains will be isolated, cloned and (v) their mutation rates will be measured; (vi) possible relationship of structure and function of RdRp will be revealed; (vii) at least one stable PRRSV strain with high fidelity RdRp will be cloned which can serve as a basis for MLV development.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Our results can answer some important questions in basic research: (i) what the structural reason of RdRp infidelity is, (ii) what the exact value of RdRp mutation rate is and (iii) how much we can increase the RdRp fidelity. A high fidelity RdRp strain created by us can serve as the backbone for development of modified live PRRSV vaccine strains in the future.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. In the late 1980s a previously unknown disease was recognized in swine herds in the USA, a few years later in Europe, and recently it is pandemic in China. The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) causes an estimated loss of more than $1 billion per year worldwide. The causative agent of the disease, PRRS-virus (PRRSV) – like any other virus – can inject its genetic material into different cells of the swine, replicates itself and kills the cell, causing severe illness or even the animal’s death. So far no effective vaccine has been developed against the virus. One of the reasons of the failure is that PRRSV (similarly to other RNA viruses) copies its genetic material in a very inaccurate way, so its genome collects a lot of mutations and the virus can change itself rapidly. This tendency for rapid change causes serious problems in vaccine development. Even weakened vaccine strains can keep their ability to mutate rapidly and turn themselves into strong, virulent virus inside the vaccinated animal. So sometimes the vaccine itself causes the illness it aimes to prevent. The goal of our research is to reduce the mutation capability of the virus and to find such mutants that cannot revert into virulent virus and therefore can serve as basis for vaccine development. We also hope that our results can help in fighting other RNA viruses.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
Mivel a PRRSV mutagenezisét nem tudtuk a publikált módon elvégezni, ezért létrhoztunk egy módosított, qPCR alapú eljárást arra, hogy a vírusgenom kópiaszámának és a ftőzési fókuszok számának arányát követni tudjuk.
Az egylépéses, PCR alapú klónozás helyett - melynek beállítását egyelőre nem tudtuk megoldani - hagyományos úton kezdtük el klónozni a HU14432/2011 PRRSV törzset. Ehhez meghatároztuk a törzs teljes szekvenciáját egy másik magyar izolátummal (9625|2012) együtt. A szekvenciák analíziséből készült cikket benyújtottuk publikálásra.
A kezdeti eGFP alapú stratégiát dsRED alapú stratégiára váltottuk. Végrehajtottuk az első dsRED alapú kísérleteket (a dsRED mutánsok létrehozását, immunfluorescens kimutatását és a flow analízis beállítását).
kutatási eredmények (angolul)
PRRSV mutagenesis to obtain high RdRp fidelity cannot be done on the way that was published. We modified the method and developed a qPCR based method to follow the ratio of viral genome and viral foci.
Instead of using the PCR based cloning (which challenge remained unsolved) we started to use conventional cloning of the HU14432/2011 strain. As a first step of it, we determined the complete sequence of the strain and an onther Hungarian strain 9625|2012. The sequence results and their bioinformatical analysis is under publication.
We rebuilt our strategy of using eGFP into using dsRED. We carried out the first dsRED based experiments containing dsRED mutagenesis, IF and flow analysis.
