Az iszkémia/reperfúzió okozta akut veseelégtelenség proteomikai analízise: új terápiás célpontok azonosítása  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »
 

Projekt adatai

  
azonosító
105361
típus PD
Vezető kutató Balicza-Himer Leonóra
magyar cím Az iszkémia/reperfúzió okozta akut veseelégtelenség proteomikai analízise: új terápiás célpontok azonosítása
Angol cím Proteomic analysis of renal ischemia/reperfusion injury: determining new therapeutic target molecules
magyar kulcsszavak iszkémia/reperfúzió, akut veseelégtelenség, proteomika
angol kulcsszavak ischemia/reperfusion injury, acut renal failure, proteomics
megadott besorolás
Nefrológia, urológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)60 %
Ortelius tudományág: Nefrológia
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)40 %
Ortelius tudományág: Molekuláris markerek és azonosításuk
zsűri Élettan, Kórélettan, Gyógyszertan és Endokrinológia
Kutatóhely Gyermekgyógyászati és Nephrológiai Kutatócsoport (HUN-REN Támogatott Kutatócsoportok Irodája)
projekt kezdete 2012-09-01
projekt vége 2017-03-31
aktuális összeg (MFt) 7.440
FTE (kutatóév egyenérték) 1.96
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Az akut veseelégtelenség (ARF) egyik leggyakoribb oka az iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodás. Iszkémia során a csökkenő oxigénszint a vese tubulus-, és endotélsejtjeinek pusztulásához, a vesekeringés megváltozásához és gyulladásos reakciókhoz vezet. Az oxigéndús vér reperfúziójához (a véráramlás újbóli megindulása) másodlagos gyulladásos folyamatok egész sorozata társul, amelyek tovább súlyosbíthatják a beteg állapotát. A jelenleg rendelkezésre álló megelőzési stratégiák és terápiás lehetőségek behatároltak, és közülük egyik sem képes lényegesen megváltoztatni a betegség halálozási arányát. Az iszkémiás prekondícionálás (IP) egy olyan, az iszkémia/reperfúziót megelőző állapotot jelöl, amely fokozza a szövet stressztűrő képességét, és ezáltal védelmet nyújthat egy későbbi, súlyosabb I/R okozta károsodással szemben. Néhány fehérje, melyeknek expressziója megváltozik a prekondícionálás során, fontos szerepet játszhat a sérült szövetek túlélésének hosszabb távú biztosításában. Az I/R károsodás pontos patomechanizmusának ismerete elengedhetetlen olyan új terápiás lehetőségek kidolgozásához, melyek javítják az ARF tüneteit és megakadályozzák a későbbi szövődmények (vesetranszplantátum kilökődése, fibrózis, tubulusstruktúra felbomlása) kialakulását.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Kutatásunk célja a vese I/R károsodás komplex molekuláris patomechanizmusának feltárása beállított állatmodellünk segítségével. Vizsgáljuk továbbá az IP hatására bekövetkező fehérjeszintű változásokat a vesében, amely új, a terápia szempontjából jelentős célmolekulák megtalálásához vezethet. Ennek során kétdimenziós elektroforézis és tömegspektrometria segítségével azonosítjuk a fehérjeprofilban történt változásokat, valamint feltérképezzük a különböző fehérjék közti kapcsolatrendszert négy kísérleti csoportunkban (kontroll (C), prekondícionált (IP), iszkémia/reperfúziós (I/R) illetve prekondícionált, majd iszkémia/reperfúziónak kitett (IP+I/R) vesék). Előzetes vizsgálataink során azonosítottunk néhány lehetséges célmolekulát, melyek lényeges szerepet játszhatnak az I/R okozta vesekárosodásban. Ezek közül az egyik egy eddig ismeretlen fehérje (’unknown protein-UP’), amely fontos szerepet játszhat a vese I/R okozta károsodásában és fibrotikus folyamataiban is. Célunk az ’UP’ fehérje alapvető tulajdonságainak és szöveti lokalizációjának leírása, továbbá pontos funkciójának meghatározása az I/R károsodás illetve más vesebetegségek patomechanizmusában in vitro és/vagy in vivo kísérleti rendszerek segítségével.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Az I/R mechanizmusával kapcsolatos eddigi ismereteink ellenére jelenleg nem áll rendelkezésre olyan vizsgálat, amely teljeskörű információt nyújtana az iszkémia/reperfúziót követő proteomikai változásokról a vesében. Ezért mi szeretnénk elvégezni beállított I/R állatmodellünkön a veseminták teljes összehasonlító proteomikai analízisét. Eredményeink elősegíthetik az I/R okozta akut vesekárosodás bonyolult patofiziológiájának és központi folyamatainak jobb megértését. Mivel az iszkémiás prekondícionálás hosszabb távon kedvezően befolyásolhatja a károsodott veseszövetek állapotát, az I/R okozta akut vesekárosodásban résztvevő új fehérjék, biomarkerek és terápiás célpontok keresésének megkönnyítése érdekében vizsgálni fogjuk az IP hatására bekövetkező proteomikai változásokat is a vesében. Munkánk várhatóan az I/R nyomonkövetésére alkalmas új biomarkerek és olyan új célmolekulák azonosítására nyújt lehetőséget, melyek fontos szerepet játszanak az I/R patomechanizmusában – különös tekintettel az eddig ismeretlen ’UP’ fehérjére. Kutatásaink kiindulópontként szolgálhatnak olyan, a vese védelmét szolgáló új terápiás szerek kifejlesztéséhez, melyek javíthatják az akut veseelégtelenségben szenvedő betegek túlélési arányát.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A nagyobb műtétek, trauma, égések, súlyos hipovolémiás állapotok, újraélesztés, sokkos állapot illetve vesetranszplantáció gyakori velejárójaként fellépő akut veseelégtelenség leggyakoribb oka az iszkémia/reperfúzió (I/R) okozta károsodás. Az iszkémia során fellépő oxigén-és tápanyaghiányos állapotot követően a véráram újbóli megindulása (reperfúzió) másodlagos gyulladást okozva tovább ronthat a helyzeten. Az ARF kezelése máig komoly probléma az intenzív osztályok számára. A betegség halálozási aránya nem csökkent jelentősen az elmúlt évtizedekben, és kezelése sem megoldott. Az I/R okozta vesekárosodás meglehetősen összetett folyamat, és jelenlegi ismereteink alapján pontos patomechanizmusa egyelőre tisztázatlan. Vizsgálatunkban a folyamat egy új típusú, rendszerbiológiai megközelítését tűztük ki célul. E célból az I/R károsodás vizsgálatához beállított állatmodellünkben elvégezzük a veseminták teljes proteomikai vizsgálatát. Eredményeink elősegíthetik az I/R okozta akut vesekárosodás központi folyamatainak és a prekondícionálás (rövid ideig tartó iszkémia/reperfúzió) védő hatásának jobb megértését. Munkánk várhatóan az I/R nyomonkövetésére alkalmas új biomarkerek és a terápiás úton megcélozható molekulák azonosítására nyújt lehetőséget.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Ischemia/reperfusion (I/R) injury is a leading cause of acute kidney failure (ARF). During ischemia the level of oxygen decreases (hypoxia), which leads to tubular and endothelial cell damage, altered renal vascular function and inflammatory processes. Reperfusion with oxygenated blood (re-establishment of blood flow) is associated with a complex series of secondary inflammatory events, which will further aggravate the patient's condition. Our current possibilities are limited to preventive and supportive therapy strategies, none of which have been definitively shown to alter mortality. Ischemic preconditioning (IP) generally consists of a short period of ischemia followed by reperfusion, which is known to induce tissue adaptation to stress and may protect from a subsequent severe I/R insult. Some of those proteins which are altered during preconditioning should be responsible for the better long term condition of the injured tissue. Understanding the exact patomechanism of I/R injury is indispensable to improve new therapeutic strategies which may negate ARF and prevent the late complications, such as renal transplant rejection, fibrosis and tubular loss.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Our present aim is the understanding of the complex molecular pathomechanism of renal I/R injury using an established animal model. Furthermore, we will investigate the IP induced proteomic changes of the kidney, which will help us to find new targets for therapeutic intervention. We namely investigate the alteration in the proteomic profile and complex interaction of different proteins of our four experimental groups (control (C), preconditioned (IP), ischemic/reperfused (I/R) and preconditioned and later ischemic/reperfused (IP+I/R) kidneys) using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Moreover, we performed preliminary experiments, which have already led us to the identification of some potential key molecules of renal I/R injury. One of these is a previously unknown protein (UP), which may have an important role in I/R injury and in fibrotic processes. Our present aim is to describe the basic properties and tissue localization of this protein, and make in vitro and/or in vivo functional experiments to determine its exact role in the pathomechanism of I/R injury and in other kidney diseases.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
Despite of our recent knowledge about I/R injury, there is no report about the full proteomic changes of the kidney following ischemia-reperfusion. Therefore we perform the full comparative proteomic analysis of kidney samples in our established animal model of I/R injury. Our expected results may help to understand the complex pathophysiology and common key elements of acute renal failure caused by ischemia. Since ischemic preconditioning should be responsible for the better long term condition of the injured kidney, we will investigate the IP induced proteomic changes and altered proteins in the kidney to facilitate the searching for new proteins, biomarkers and therapeutic targets of renal ischemic injury induced ARF. The anticipated outcome of our work is finding new biomarkers for monitoring I/R injury, and the identification of new target molecules contributing to its pathomechanism, with special focus on a previously unknown protein (UP). Our findings may also offer possible targets for modulation and intervention by new renoprotective agents, which may improve the survival rate of patients with ARF.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Ischemia-reperfusion (I/R) induced acute kidney failure (ARF) is observed most frequently in patients after major surgery, trauma, burns, severe hypovolemia, resuscitation, shock and renal transplantation. Ischemia occurs a period of absence of oxygen and nutrients, which can be worsened by the re-establishment of blood flow (reperfusion) because it leads to a secondary inflammation. Healing of ARF means a serious problem in the intensive health care. The mortality rate of the illness was not decreased considerable in the last decades and its treating is unresolved. I/R induced renal injury is a complex process, and to our recent knowledge the exact pathomechanism is still unclear. In our study we plan to describe the process in a new aspect of the system biology. For this purpose, we perform the full proteomic analysis of kidney samples in our established animal model of I/R injury. Our expected results may help to understand the common key elements of ischemia reperfusion leading to kidney damage and the potential protective effects of ischemic precondition (a short period of ischemia followed by reperfusion). Our findings may offer new biomarkers for monitoring I/R injury and possible targets for modulation and intervention.




 

Zárójelentés

  
kutatási eredmények (magyarul)
Az egészségügyi ellátás fejlődése ellenére az akut veseelégtelenség (ARF) gyógyítása mind a mai napig komoly nehézséget okoz. A humán gyógyászatban az ARF egyik leggyakoribb oka a vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása, ezért ennek a folyamatnak a komplex proteomikai vizsgálatát, új biomarkerek és terápiás célpontok keresését tűztük ki kutatásunk céljául. Hím ivarérett Wistar patkányokon létrehoztuk a vese I/R károsodásának állatmodelljét, és elvégeztük a veseminták összehasonlító proteomikai analízisét kétdimenziós elektroforézis és folyadékkromatográfia-tömegspektrometria segítségével. 108 szignifikáns változást mutató fehérjét azonosítottunk, melyeket adatbázisok segítségével funkcionális, illetve génontológiai csoportokba rendeztünk, a közöttük lévő kapcsolatrendszert feltártuk. Elemzésünkkel az I/R indukálta károsodás folyamatában központi szerepet betöltő molekulaként azonosítottuk a Parkinson’s disease 7-et (PARK7). Igazoltuk a PARK7 protektív hatását az oxidatív stressz okozta károsodással szemben. Vizsgálatainkat az ARF mellett más oxidatív stresszel járó kórképekre, így a gyulladásos bélbetegségre, illetve cöliákiára is kiterjesztettük. Az OTKA támogatásával számos jelentős lépést sikerült tennünk az ARF kiváltó okaként ismert I/R vesekárosodás molekuláris mechanizmusának megértéséhez. Az általunk azonosított, I/R patomechanizmusában szerepet játszó fehérjék - különös hangsúlyt fektetve a PARK7-re-, a későbbiekben az ARF terápiás célpontjai lehetnek.
kutatási eredmények (angolul)
Despite development in the intensive health care, treatment of acute renal failure means a serious problem. The leading cause of acute renal failure (ARF) is ischemia/reperfusion (I/R) induced injury, thus our aim was to better understand its complex pathomechanism and to find new biomarkers and therapeutic targets. Using the rat model of I/R induced ARF, comparative proteomic analysis of kidney samples using two-dimensional gel electrophoresis followed by mass spectrometry was performed. Our analysis revealed 108 significantly altered proteins in the kidney after I/R induced injury. According to databases, these proteins were sorted into functional and gene ontological groups, and possible connections were explored between them. Based on our analyses, we identified the central role of Parkinson’s disease 7 (PARK7) in the patomechanism of I/R induced kidney damage. Moreover we demonstrated its protective role against cell damage caused by oxidative stress. Besides ARF, our experiments were also extended to other oxidative stress related diseases, such as inflammatory bowel diseases and coeliac disease. Summarizing the results of the present proposal supported by OTKA, substantial steps were made to explore molecular events of I/R induced ARF. We identified numerous proteins playing roles in the patomechanism of I/R, of which PARK7 may serve as therapeutic target in the treatment of ARF in the future.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=105361
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

  
Rita Lippai, Erna Sziksz, Domonkos Pap, Réka Rokonay, Apor Veres-Székely, Andrea Fekete, Attila J. Szabó, Ádám Vannay: Involvement of PARK7 in the pathomechanism of inflammatory bowel diseases, 202. FALK Symposium (Prága, Csehország) – 2016. április 29-30., 2016
Rita Lippai, Erna Sziksz, Domonkos Pap, Réka Rokonay, Apor Veres-Székely, Attila J. Szabó, Ádám Vannay: Involvement of PARK7 in the pathomechanism of inflammatory bowel diseases, The 8th Conference of PhD Students (Marosvásárhely, Románia) – 2015. december 7-11., 2015
Réka Rokonay, Erna Sziksz, Domonkos Pap, Apor Veres-Székely, Rita Lippai, Gábor Veres, Ádám Vannay: Involvement of the cytokines of IL-20 subfamily in the pathogenesis of coeliac diseases, The 8th Conference of PhD Students (Marosvásárhely, Románia) – 2015. december 7-11., 2015
Réka Rokonay, Erna Sziksz, Domonkos Pap, Apor Veres-Székely, Rita Lippai, Attila J. Szabó, Ádám Vannay: Involvement of the cytokines of IL-20 subfamily in the pathogenesis of coeliac diseases, PhD Scientific Meeting 2016 (Budapest, Magyarország) – 2016. április 7-8., 2016
Rita Lippai, Erna Sziksz, Domonkos Pap, Réka Rokonay, Apor Veres-Székely, Gábor Veres, Tivadar Tulassay, Attila J.Szabó, Ádám Vannay: Involvement of PARK7 in the pathomechanism of inflammatory bowel diseases, PhD Scientific Meeting 2016 (Budapest, Magyarország) – 2016. április 7-8., 2016
Sziksz Erna, Himer Leonóra, Kékesi Katalin, Juhász Gábor, Simor Attila, Gulyássy Péter, Darula Zsuzsanna, Ónody Anna, Pap Domonkos, Szebeni Beáta, Tulassay Tivadar, Vannay Ádám.: Új biomarkerek azonosítása proteomikai analízissel az iszkémia-reperfúzió okozta akut vesekárosodás kapcsán, Magyar Nephrologiai Társaság XXIX. Nagygyűlése (Siófok) – 2012 Október 4-6., 2012
Erna Sziksz, Leonóra Himer, Katalin A. Kékesi, Gábor D. Juhász, Attila Simor, Péter Gulyássy, Zsuzsanna Darula, Beáta Szebeni, Tivadar Tulassay, Ádám Vannay.: Proteomic analysis of renal ishaemia/reperfusion injury: identification of potential new targets., 1. European Society for Pediatric Nephrology 45th Annual Scientific Meeting (Krakkó, Lengyelország) – 2012. szeptember 6-8., 2012
Sziksz Erna, Himer Leonóra, Vannay Ádám.: Fehérjék relatív mennyiségének meghatározása western blot technikával., Gyermekgyógyászat. 64(1)9., 2013
Erna Sziksz, Leonóra Himer, Katalin A. Kékesi, Gábor D. Juhász, Attila Simor, Péter Gulyássy, Zsuzsanna Darula, Beáta Szebeni, Tivadar Tulassay, Ádám Vannay.: Proteomic analysis of renal ishaemia/reperfusion injury: identification of potential new targets., Pediatr Nephrol 27:1605–1829. P279, 2012
Sziksz Erna, Himer Leonóra, Kékesi Katalin, Juhász Gábor, Simor Attila, Gulyássy Péter, Darula Zsuzsanna, Ónody Anna, Pap Domonkos, Szebeni Beáta, Tulassay Tivadar, Vannay Ádám.: Új biomarkerek azonosítása proteomikai analízissel az iszkémia-reperfúzió okozta akut vesekárosodás kapcsán., Hypertonia és Nephrologia, 16(suppl.2):S1-S72, 2012
Sziksz E; Himer L; Kékesi K; Juhász G; Simor A; Gulyássy P; Darula Zs; Ónody A; Pap D; Szebeni B; Tulassay T; Vannay Á.: Új biomarkerek azonosítása proteomikai analízissel az iszkémia-reperfúzió okozta akut vesekárosodás kapcsán, Magyar Nephrologiai Társaság XXIX. Nagygyűlése (Siófok) – 2012 Október 4-6., 2012
Sziksz E; Himer L; Kékesi KA; Juhász DG; Simor A; Gulyássy P; Darula Zs; Szebeni B; Tulassay T; Vannay Á.: Proteomic analysis of renal ishaemia/reperfusion injury: identification of potential new targets., European Society for Pediatric Nephrology 45th Annual Scientific Meeting (Krakkó, Lengyelország) – 2012. szeptember 6-8., 2012
Sziksz E; Himer L; Vannay Á.: Fehérjék relatív mennyiségének meghatározása western blot technikával., Gyermekgyógyászat. 64(1)9., 2013
Sziksz E; Himer L; Kékesi AK; Juhász DG; Simor A; Gulyássy P; Darula Zs; Szebeni B; Tulassay T; Vannay Á.: Proteomic analysis of renal ishaemia/reperfusion injury: identification of potential new targets., Pediatr Nephrol 27:1605–1829. P279, 2012
Sziksz E; Himer L; Kékesi K; Juhász G; Simor A; Gulyássy P; Darula Zs; Ónody A; Pap D; Szebeni B; Tulassay T; Vannay Á.: Új biomarkerek azonosítása proteomikai analízissel az iszkémia-reperfúzió okozta akut vesekárosodás kapcsán., Hypertonia és Nephrologia, 16(suppl.2):S1-S72, 2012
Sziksz E; Molnár K; Lippai R; Pap D; Ónody A; Veres-Székely A; Vörös P; Szabó D; Győrffy H; Veres G; Tulassay T; Vannay Á; Arató A.: Peroxisome proliferator-activated receptorγ and thymic stromal lymphopoietin are involved in the pathophysiology of childhood coeliac disease., Virchows Archiv, 465(4):385-93, 2014
Vörös P; Sziksz E; Himer L;, Ónody A; Pap D; Frivolt K; Szebeni B; Lippai R; Győrffy H; Fekete A; Brandt F; Molnár K; Veres G; Arató A; Tulassay T; Vannay Á.: Expression of PARK7 is increased in coeliac disease., Virchows Arch. 2013; 463(3):401-8., 2013
Sziksz E; Pap D; Fekete A; Veres G; Tulassay T; Vannay Á.: Involvement of heat shock proteins in gluten-sensitive enteropathy., World Journal of Gastroenterology. 2014; 20(21):6495-6503., 2014
Béres NJ; Sziksz E; Vannay Á; Szabó D; Pap D; Veres-Székely A; Arató A; Szabó AJ, Veres G.: Role of the microbiome in celiac disease., International Journal of Celiac Disease, 2014 2 (4), pp 150-153., 2014
Pap D; Himer L; Sziksz E; Vannay Á.: Transzgénikus állatok az orvosbiológiai kutatásokban., Gyermekgyógyászat, 2014, 65:(2) pp. 67-68., 2014
Rokonay R; Sziksz E; Lippai R; Pap D; Veres-Székely A; Szabó A; Vannay Á.: A vesefibrózisban szerepet játszó szignalizációs útvonalak., Hypertonia és Nephrologia, 2014; 18(3-4):72-5, 2014
Sziksz E; Pap D; Lippai R; Béres NJ; Fekete A; Szabó AJ, Vannay Á.: Fibrosis related inflammatory mediators: role of the IL-10 cytokine family., Mediators Inflamm. 2015;2015:764641. doi: 10.1155/2015/764641., 2015
Sziksz E; Molnár K; Lippai R; Pap D; Ónody A; Veres-Székely A; Vörös P; Szabó D; Győrffy H; Veres G; Tulassay T; Vannay Á; Arató A: A PPAR-γ és a TSLP szerepének vizsgálata gyermekkori coeliákiában., Magyar Gyermekgasztroenterológiai Társaság IV. Kongresszusa – 2014. Október 2-4., 2014
Lippai R; Sziksz E; Pap D; Rokonay R; Veres-Szekely A; Onody A; Fekete A; Veres G; Arato A; Tulassay T; Szabo AJ; Vannay A.: Involvement of PARK7 in the pathomechanism of inflammatory bowel diseases., 24th Meeting of European Society of Paediatric Clinical Research (Budapest) – 2015. június 19-20., 2015
Pap D; Onody A; Sziksz E; Veres-Szekely A; Himer L; Lippai R; Rokonay R; Fekete A; Veres G; Arato A; Tulassay T; Szabo AJ; Vannay A.: Interleukin-24 is a modulator of tissue remodeling in inflammatory bowel disease., 24th Meeting of European Society of Paediatric Clinical Research (Budapest) – 2015. június 19-20., 2015
Lippai R; Sziksz E; Pap D; Rokonay R; Veres-Szekely A; Onody A; Fekete A; Veres G; Arato A; Tulassay T; Szabo AJ; Vannay A.:: A PARK7 szerepe gyulladással járó bélbetegségekben, A Magyar Élettani Társaság 79. Vándorgyűlése és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság 2015. évi konferenciája (Szeged). – 2015. május 27-30., 2015
Fekete A; Vannay Á.: A diabetes nephropathia jelentősége gyermekkorban, Orvosi hetilap, 2014. (155. évf.) 4. sz. 141-150. old., 2014



vissza »