Szekretált és membránfehérjék poszttranszlációs módosításainak jellemzése
Angol cím
Method development for the selective enrichment and mass spectrometric characterization of posttranslational modifications of secreted and membrane proteins
magyar kulcsszavak
poszt-transzlációs módosítás, O-glikoziláció, foszforiláció, szulfatálás, tömegspektrometria, elektron transzfer disszociáció
angol kulcsszavak
post-translational modifications, O-glycosylation, phosphorylation, sulfation, mass spectrometry, electron transfer dissociation
megadott besorolás
Analitikai kémia (Műszaki és Természettudományok Kollégiuma)
90 %
Ortelius tudományág: Műszeres analitika
Bioinformatika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
5 %
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
5 %
Ortelius tudományág: Biokémia
zsűri
Kémia 1
Kutatóhely
Proteomikai Laboratórium (HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
résztvevők
Hunyadi-Gulyás Éva Csilla Klement Éva Medzihradszky Katalin
projekt kezdete
2013-01-01
projekt vége
2016-12-31
aktuális összeg (MFt)
41.224
FTE (kutatóév egyenérték)
6.40
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A jelenlegi pályázat célja módszer-fejlesztés szekretált és membránfehérjék O-glikozilációjának, foszforilációjának és szulfatálásának jellemzésére. Új frakcionálási módszereket kívánunk bevezetni a szekretált O-glikoproteinek átfogó jellemzésére. A glikopeptidek azonosítását a leghatékonyabb tömegspektrometriás módszerrel, elektron transzfer disszociáció segítségével végezzük el. Számos új glikozilációs hely és glikozilált fehérje megbízható azonosítása hozzásegít ahhoz, hogy jobban megismerjük ennek a gyakori poszt-transzlációs módosításnak a biológiai funkcióit. A szérumfehérjék poszt-transzlációs módosításainak jobb megismerésével közelebb kerülhetünk biomarkerek felfedezéséhez. A szérumfehérjékre kidolgozott mintaelőkészítési eljárásokat membránfehérjékre is adaptáljuk. A sejtmembránba ágyazott fehérjék poszt-transzlációs módosításainak feltérképezésével jobban megérthetjük olyan fontos élettani folyamatok molekuláris alapjait, mint a sejtadhézió vagy szubsztrát-kötődés.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A javasolt projekt ún. felfedezés-irányított kutatás. Kiválasztott és membrán fehérjék poszt-transzlációs módosításait akarjuk azonosítani, hogy ezen adatok alapján hipotézisek és azokon alapuló kutatások születhessenek majd. A fehérjék poszt-transzlációs módosításai alapvetően befolyásolják működésüket, ezért ezen módosítások átfogó vizsgálata segíti a különböző életfolyamatok megértését. A poszt-transzlációs módosítások jellemzését erősen megnehezíti, hogy 1) egy adott fehérje-populáció heterogén lehet mind a módosítás mennyiségét, mind helyét illetően 2) a módosítások élettartama lehet igen rövid (dinamikus módosítások), relatív mennyisége rendkívül alacsony 3) a vizsgált fehérje-elegyek koncentráció eloszlása több nagyságrendet lefed. Ezért megfelelő mintaelőkészítési eljárásokat kell kidolgozni, melyek alkalmasak a módosított fehérjék / peptidek dúsítására. Ilyen módszerek nélkül a módosítások feltérképezése lehetetlen. A pályázat keretében különböző peptid- és fehérje-szintű kromatográfiás elválasztásokat fogunk kidolgozni, melyek szérum-fehérjék O-glikoziláció, foszforiláció és szulfatálás vizsgálatát teszik lehetővé. A megfelelő minta-előkészítés után tömegspektrometriás analízissel állapítjuk meg, hogy mely fehérjék mely aminosavai vannak módosítva. A szekretált és membránfehérjék módosításainak feltérképezése elősegítheti a biomarker-kutatást és különböző életfolyamatok jobb megértését teszi lehetővé.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A fehérje poszt-transzlációs módosítások biológiai szerepének megértéséhez szükség van bizonyos mennyiségű ismeret felhalmozására – fontos tudni pl. egy adott módosítás gyakoriságát, lokalizációját, fajok közötti konzerváltságát stb. A tudomány jelenlegi állása szerint számos poszt-transzlációs módosítás -így az általunk jellemezni kívánt extracelluláris O-glikoziláció, foszforiláció és szulfatálás is – jellemzése még ebben az „eredeti adatfelhalmozás” fázisában van. A pályázatban tervezett mintaelőkészítési eljárások kidolgozásával és az ezt követő tömegspektrometriás vizsgálattal minden bizonnyal jelentősen hozzájárulunk ehhez a tudásbázishoz. Ennél fontosabb azonban, hogy – mivel a fehérjék glikozilációs profilja számos betegségben, pl. rákban erősen megváltozik - a kidolgozott módszerek a biomarker-kutatás eszköztárát bővítik, összehasonlíthatók lesznek egészséges és rákos betegek vérmintái, vagy különböző daganatok összehasonlítása is lehetővé válik. A membránfehérjék vizsgálata révén pedig közelebb jutunk ahhoz, hogy megértsük a molekuláris mechanizmusát olyan fontos folyamatoknak, mint pl. a sejtadhézió, szubsztrát- kötődés.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Hogy jobban tudjunk segíteni a betegeken, meg kell ismernünk az egészséges szervezetet. A gének megmondják,milyen aminosavakból állnak össze a fehérjék, de nem árulják el, melyek kerülnek “gyártásra”, és szintézisük után milyen működésüket befolyásoló módosításokra tesznek szert. Ezeket kívánjuk tanulmányozni. Gyakori, hogy csak kevés fehérje módosított, a módosítás rövid életű, vagy a bennünket érdeklő fehérje nagyon ritka. Így a módosított molekulákat ki kell halászni a nem módosítottak tengeréből. Dúsítási eljárásokat fejlesztünk, és az izolált molekulákat azonosítjuk. Kiválasztott vagy sejt-felületi fehérjéken előforduló módosításokat vettünk célba. Könnyen hozzáférhető testfolyadékokat (bennük találhatók a kiválasztott fehérjék), mint pl. vért, gyakran használunk különböző betegségek diagnosztizálására és követésére. A vizsgálandó módosítások O-glikoziláció, foszforilálás, szulfatálás, mind előfordulnak pl. a véralvadásban szerepet játszó fehérjéken. Tudott, hogy rákos megbetegedés esetén a glikoziláció módosul. De nem ismert, mely fehérjéket érinti a változás. A többi módosításnál is még a kezdeteknél tartunk. A kutatásainkból származó ismereteknek hosszú távon diagnosztikai, prognosztikai jelentősége lehet. A sejtmembránban elhelyezkedő fehérjék központi szerepet játszanak a sejtek és a “külvilág” közötti kapcsolat megteremtésében, biztosítják az anyag-, energia- és információáramlást és szerkezeti kapcsolatot teremtenek a sejt és környezete között. Ezekben a folyamatokban szintén szerepe van a fehérjék módosításainak, ezért ezek feltérképezése mind az életfolyamatok jobb megértésében, mind különböző betegségek kialakulásának vizsgálatában nagy jelentőséggel bír.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. We propose method development for enrichment and characterization of O-glycosylation, phosphorylation and sulfation, frequent post-translational modifications of proteins. We want to introduce new chromatographic methods to fractionate serum glycoproteins, and for the charactarization of glycopeptides we intend to utilize the best mass spectrometry strategy available: electron-transfer-dissociation on a high mass accuracy and detection sensitivity mass spectrometer. Understanding the PTMs of the serum proteins may eventually provide the key in the on-going search for elusive biomarkers. In addition, we want to utilize the methods developed for the analysis of membrane proteins. Deciphering the PTMs of proteins coating the cell surface may bring us closer to understanding the molecular basis of such important processes as cell adhesion, and substrate docking etc.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The proposed project is discovery-driven research. We want to identify the post-translational modifications (PTMs) of secreted and membrane proteins. The resulting data will serve as the basis of new hypotheses and research driven by them. PTMs usually alter protein function, therefore characterization of different modifications enables understanding of different cellular processes. However, comprehensive characterization of PTMs may prove to be an elusive goal for a series of reasons i) protein-populations may feature heterogeneity both in the extent and site of modification(s); ii) modifications may be short-lived (dynamic) as well as present in substoichiometric quantities; iii) because of the high dynamic range of protein concentration of the mixture studied. Therefore, appropriate sample preparation protocols that enable selective isolation of modified proteins or peptides are prerequisite of successful PTM profiling. In this study we intend to investigate different chromatographic approaches for the selective isolation of serum and membrane proteins/peptides modified by O-glycosylation, phosphorylation and sulfation. Downstream analysis by mass spectrometry would reveal which proteins at what sequence positions are modified. The proposed method development would yield highly useful tools for biomarker research and facilitate the better understanding of important cellular events.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. In order to understand the biological significance of protein post-translational modifications we need to possess a certain amount of knowledge about their occurrence frequency, their localization, and the conservation of modifications sites etc. Currently, mainly due to the lack of appropriate sample preparation methodologies and limitation of routine downstream mass spectrometric analysis, very little is known about extracellular O-glycosylation, phosphorylation and sulfation. Thus, we are in a „data-gathering” phase as far as these modifications are concerned. We definitely will contribute to this knowledge „database” even during the method development phase. More importantly, once reliable protocols are in hand we can use the methods on ‘real’ samples. Thus, serum glycosylation of healthy individuals and cancer patients could be compared; similarly the glycosylation of tumor samples could be investigated; the glycosylation patterns in lipid rafts could be studied. Deciphering the post-translational modifications of proteins coating the cell surface may bring us closer to understanding the molecular basis of such important processes as cell adhesion or substrate docking.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. In order to better help the sick, one should understand the working of the healthy body. Genes code the amino acid sequence of proteins but fail to reveal which ones will be „produced” or what activity-altering modifications will proteins obtain after their synthesis. We intend to study such modifications. Frequently, only a low percentage of proteins is modified, the modification may be short lived, or the protein we are after may be of low abundance. Thus, the modified molecules have to be fished out from the „sea” of unmodified ones. We will develop enrichment methods and then we will identify the molecules isolated. We will focus on modifications of proteins secreted or “coating” the cell-surface. Readily available body fluids (secreted proteins are located here), such as blood, are frequently used for diagnostic purposes. The modifications to be studied: O-glycosylation, phosphorylation, and sulfation all occur, for example, on proteins participating in the coagulation cascade. Glycosylation changes have been reported in cancer. But we do not know which proteins are affected. Knowledge on the two other modifications is also limited. Results of our research may have diagnostic or prognostic values in the long run. Proteins located in the cell membrane play gatekeeper between the cell and the outside world. They participate in material-, energy-, and signal-transport, maintain interaction between the cell and its surroundings. The modifications to be studied may influence these processes, therefore their characterization would lead to the better understanding of cellular processes both in healthy and diseased states.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
Kidolgoztunk két olyan lektin affinitáson alapuló mintaelőkészítési eljárást, amely alkalmas szérumfehérjék O-glikozilációjának tömegspektrometriás jellemzésére, a hatékonyabb módszer reprodukálhatóságát igazoltuk. A munka során azonosítottunk zavaró mellékreakciókat, és jelentősen növeltük tapasztalatainkat a glikopeptidek MS/MS adatainak kiértékeléséről. Ezek a tapasztalatok segítik a kiértékelő szoftverek optimalizálását. Rendszeres eszmecserét folytatunk a Byonic és Protein Prospector fejlesztőivel, és a HUPO 2016 World Congress során részt vettünk egy glikozilációs analízisnek szentelt bioinformatikai workshopon.
Kidolgoztunk egy olyan immobilizált fémion affinitás kromatográfiás mintaelőkészítési eljárást, ami lehetővé teszi, hogy a szérumfehérjék foszforilációját és glikozilációját akár külön, akár egy mintában is vizsgálhassuk; a módszer reprodukálhatóságát igazoltuk.
Mások által publikált adatok gondos megvizsgálásával bebizonyítottuk, hogy rengeteg elérhető információ van már extracelluláris foszforilációról, és jeleztük, hogy valószínűleg akadnak még Golgiban lakó azonosítatlan kinázok.
Ezekkel a módszerekkel vizsgálhatjuk mind a glikoziláció, mind a foszforiláció „általánosságát”, vagy egyéni változatosságát, továbbá tesztelhetjük, hogy bizonyos kórképek (pl. rák és autoimmun betegségek) produkálnak-e egyértelműen detektálható változásokat, azaz lelünk-e PTM-alapú biomarkert.
kutatási eredmények (angolul)
We have developed two lectin affinity chromatography based sample preparation workflows that enable efficient enrichment of core-1 type O-glycopeptides from human serum. We have also demonstrated the reproducibility of the more efficient workflow. In this process we also identified disturbing side reactions, and gained significant knowledge on the interpretation of glycopeptide MS/MS data. This knowledge shared may help to improve the performance of the search engines. We are in contact with the developers of Byonic and Protein Prospector, and at the HUPO 2016 World Congress also participated in a bioinformatics workshop devoted to glycosylation analysis.
We optimized the immobilized metal ion affinity chromatography approach for the phosphorylation analysis of serum samples. Our new approach enables single-step analysis of phosphorylation and glycosylation or can be fine-tuned to phosphorylation only. We have demonstrated the reproducibility of the workflow.
By mining publicly available PTM data we have demonstrated that significant information has been already obtained about extracellular phosphorylation, and we indicated that most likely there are some Golgi-residing kinases unrecognized.
Our new methods can be applied to test the individual variability of these PTMs in healthy individuals, and probe for biomarkers in patients where these post-translational events are predicted to be disturbed, for example, in cancer and in some autoimmune diseases.
Darula Z., Klement E., Medzihradszky KF.: Interpretation of MS/MS spectra of O-glycopeptides, 31st IMMS 2013 Palermo; Informal Meeting on Mass Spectrometry; Mass Spectrometry: from fundamentals to omic sciences; Book of abstracts, 2013
Darula Z, Medzihradszky KF: Glycan Side Reaction May Compromise ETD-Based Glycopeptide Identification, J AM SOC MASS SPECTR 25: (6) 977-987, 2014
Darula Z; Sarnyai F; Klement E; Hunyadi-Gulyas E; Medzihradszky K.: Different sample preparation protocols for the selective isolation of human serum O-glycopeptides, Advances in Glycomics and Glycoproteomics: Methods and Applications. Asilomar Conference of ASMS, 2014
Darula Z; Sarnyai F; Klement E; Hunyadi-Gulyas E; Medzihradszky K.: Characterization of the human serum O-glycoproteome, 32nd Informal Meeting on Mass Spectrometry, book of abstracts, 2014
Hunyadi-Gulyas E; Darula Z; Medzihradszky K; Bern M.: Byonic: a highly efficient new bioinformatic tool for intact glycopeptide analysis, 32nd Informal Meeting on Mass Spectrometry, book of abstracts, 2014
Klement E; Medzihradszky K.: Alternatives in PTM analysis of serum samples, 32nd Informal Meeting on Mass Spectrometry, book of abstracts, 2014
Klement E; Raffai T; Darula Z; Hunyadi-Gulyas E; Medzihradszky K.: Combined enrichment strategies for the PTM characterization of serum proteins, Advances in Glycomics and Glycoproteomics: Methods and Applications. Asilomar Conference of ASMS, 2014
Klement E; Viczian A; Nagy F; Darula Z; Hunyadi-Gulyas E; Medzihradszky K.: Protein phosphorylation – enrichment and mass spectrometry analysis, Annual Conference of the Hungarian Biochemical Society, book of abstracts, 2014
Darula Z., Medzihradszky KF.: Factors that contribute to the complexity of glycopeptide analysis – besides site-specific heterogeneity, 62nd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, book of abstracts, 2014
Klement E, Raffai T, Darula Z, Hunyadi-Gulyas E, Medzihradszky KF: One for all? TiO2 and IMAC enrichment of phospho- and glycopeptides from serum, Proteomic Forum, 2015
