A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A sejtek a dezoxinukleotid 5’-trifoszfátok (dNTP-k) koncentrációját finomhangolt homeosztázisban tartják. A “dNTP-egyensúly” felbomlása megnövekedett mutációs gyakorisághoz (mutátor fenotípushoz) vezet. A sejteket érő genotoxikus stressz hatásai egyrészt a dNTP-készlet változásain, másrészt a DNS-károsodásra adott SOS-válaszon keresztül jelentkeznek. Nincs azonban szisztematikus ismeretünk arról, hogy a dNTP-készlet szabályozása hogyan függ össze a genotoxikus stresszhatásokkal illetve a DNS-hibajavító útvonalakkal. Modellünk a Mycobacterium smegmatis: e baktérium a tuberkulózis kórokozójának (Mycobacterium tuberculosis) közeli rokona, és azzal megegyező DNS-anyagcsere és -hibajavító útvonalakkal rendelkezik. Az intracelluláris kórokozó tuberkulózisbaktériumot a gazda immunsejtjeinek fagoszómáiban erős stresszhatások érik az immunválasz részeként és a gyógyszeres kezelés hatására is. A baktérium számára ezért kiemelkedő fontosságú a genotoxikus környezeti feltételekhez való alkalmazkodás. Ezen alkalmazkodási stratégiák felderítésére három specifikus célt jelöltünk ki: 1. Meghatározzuk a környezeti stressz és a sejtbeli dNTP-készlet mérete illetve eloszlása közötti összefüggéseket. 2. Megalkotjuk a dNTP-anyagcsere kvantitatív modelljét. 3. Meghatározzuk a dNTP-egyensúlyvesztés és -készletnövekedés függvényében megjelenő mutációs mintázatokat és indukált DNS-javító útvonalakat. Eredményeink révén megismerjük a finomhangolt dNTP-homeosztázis fenntartásának mechanizmusát, illetve az egyensúly felborulásának okait és következményeit. Megérthetjük továbbá, hogy a dNTP-készlet változásai hogyan járulnak hozzá a genotoxikus stressz-adaptáció és a drogrezisztencia kialakulásához.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Hogyan függ össze a dNTP-készlet szabályozása a genotoxikus stresszhatásokkal illetve a DNS-hibajavítás útvonalaival mikobaktérium modellszervezetben? Hipotézisünk szerint a sejtbeli dNTP-készlet szabályozása fontos eleme lehet a genotoxikus környezeti feltételekhez történő alkalmazkodási stratégiának. Az 1. részprojekt kísérleteiben meghatározzuk, hogy a környezeti stressztényezők hogyan hatnak a sejtbeli dNTP-készlet méretére és eloszlására. a különböző stressztényezők között vizsgálni fogjuk a jelenleg használt antituberkulotikus drogok hatását is. A 2. részprojektben megalkotjuk a dNTP-anyagcsere matematikai modelljét, amelyet a dNTP-készletváltozások predikciójára és a stressztényezők hatásának szimulációjára fogunk használni. A modell alkalmazásával azonosítjuk a biológiai hálózat fő szabályozó elemeit és gyenge pontjait: ez elősegítheti a gyógyszertervezést és a jelenleg alkalmazott szerek hatékonyabb használati módjainak kialakítását. A 3. részprojektben végzett kísérleteinkkel feltárjuk a stresszindukált dNTP-egyensúlyvesztés és -készletnövekedés által kiváltott mutációs mintázatokat és indukált DNS-hibajavító útvonalakat. Összességében a projekt eredményei feltárják a finomhangolt sejtbeli dNTP-egyensúly fenntartásának illetve a felborulásának mechanisztikus okait és következményeit. Az eredmények révén megérthetjük, hogy a dNTP-készlet változásai hogyan járulnak hozzá a mikobaktériumok genotoxikus stresszadaptációjához és drogrezisztenciájához.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A drogrezisztens törzsek terjedése miatt a tuberkulózis világszerte jelentős egészségügyi kockázatot jelent. A bakteirális drogrezisztencia gyakran horizontális géntranszfer tévén terjed. Mikobaktériumokban azonban (ezek közé tartozik a tuberkulózis kórokozója is) a drogrezisztencia elsősorban mutációk révén alakul ki. Mivel a mikobaktériumok normál mutációs rátája alacsony, külső faktorok – például a drogok okozta genotoxikus stressz – válthatják ki a megnövekedett mutációs gyakoriságot, amely hozzájárul a genotoxikus stresszadaptációhoz. A mutáció-indukáló mechanizmusok megértése ezért jelentősen elősegítiheti a drogrezisztencia hatékonyabb kezelését és a jelenlegieknél hatékonyabb kombinációs terápiák kialakítását. Projektünk alapkutatási jelentősége, hogy elsőként végzünk olyan szisztematikus vizsgálatokat, amelyek feltárják a dNTP-készlet változásainak összefüggéseit a belső és környezeti stresszhatásokkal és a DNS-hibajavítással. A közelmúltban a dNTP készlet-homeosztázis új szerepeire derült fény olyan fontos területeken, mint például a HIV-fertőzés elleni védekezés, a sejtciklus-szabályozás, a rákprogresszió és az öregedés. Ezért nagy jelentősége van azon mechanizmusok feltárásának, amelyek révén a DNS-építőkövek koncentráció-viszonyaiban bekövetkezett látszólag egyszerű változások olyan komplex jelenségekhez vezetnek, amelyek élet-halál kérdést jelenthetnek az adott sejt vagy szervezet számára.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A sejtek a genetikai anyag építőköveiből, a nukleotidokból rendelkezésre álló készletet precíz szabályozás alatt tartják. Ez olyan komplex folyamatokat képes döntően befolyásolni, mint például a HIV-fertőzés elleni védelem, a rákprogresszió illetve az öregedés. Hipotézisünk szerint a nukleotidkészlet szabályozása fontos szerepet játszik a tuberkulózis-kórokozó baktériumok gyógyszer-rezisztenciájának kialakulásában is. A gyógyszerrezisztens baktériumtörzsek terjedése miatt a TBC ma is világszerte jelentős egészségügyi probléma. Célunk, hogy felderítsük annak mechanizmusát, hogy a jelenleg alkalmazott tuberkulózis-gyógyszerek hogyan indukálnak a baktériumokban a rezisztenciához vezető mutációkat. Elsőként elvégezzük a stressztényezők mutációkra gyakorolt hatásának szisztematikus vizsgálatát. Modellszervezetként a tuberkulózis-baktérium közeli rokonát használjuk, amely a kórokozóéval megegyező anyagcsere-útvonalakkal rendelkezik. A kísérleteinkben alkalmazott környezeti stresszhatások között szerepelnek a jelenleg alkalmazott tuberkulózis-gyógyszerek is. Felderítjük a stressz hatására a nukleotidkészletben bekövetkezett változásokat. A nukleoitid-készletváltozási és más biokémiai adatok felhasználásával megalkotjuk a nukleotid-anyagcsere matematikai modelljét. Ezt a modellt használjuk arra, hogy prediktálni tudjuk a biológiai rendszer viselkedését különböző körülmények között, így elősegítve a gyógyszerkombinációs terápiák jelenleginél hatékonyabb módozatainak kialakítását. Végül felderítjük a környezeti stressztényezők hatására bekövetkezett mutációkat és nukleotidkészlet-változásokat, amelyek ismerete lehetővé teszi a gyógyszer-rezisztencia kialakulásának megértését.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Cells maintain a fine-tuned concentration balance in the pool of deoxyribonucleoside 5’-triphosphates (dNTPs). The perturbation of this balance results in "mutator" phenotypes characterized by increased mutation frequencies. Genotoxic stress acts upon the dNTP pool directly and also via the SOS response to DNA damage. A systematic study on how dNTP pool regulation is linked with genotoxic stresses and DNA repair pathways is missing. We wish to fill this gap in knowledge using our experience in dNTP metabolism and DNA repair. Our model is Mycobacterium smegmatis that shares the DNA metabolic and repair pathways with the tuberculosis bacterium, Mycobacterium tuberculosis. This intracellular pathogen endures harsh genotoxic conditions within the phagosomes of the host immune cells and during treatment with tuberculosis drugs. It is therefore of major importance for these bacteria to develop strategies for the adaptation to genotoxic environmental conditions. To reveal these strategies, we defined three specific aims. 1. We will establish the relationship between the exposure to environmental stress and the changes in size and balance of the cellular dNTP pool. 2. We will create a quantitative model of dNTP metabolism. 3. We will define the mutational pattern and DNA repair induction pathways in function of dNTP pool imbalances and expansion. The synthesis of the results is expected to unveil the mechanistic reasons behind the necessity of a fine tuned dNTP balance and the consequences of imbalance. We hope to understand how the changes in the dNTP pool possibly promote drug resistance as part of the adaptation to genotoxic stress.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The basic question of the proposed research is how dNTP pool regulation is linked with genotoxic stresses and DNA repair pathways in a mycobacterial model. Our hypothesis is that dNTP regulation may be part of a strategy for the adaptation to genotoxic environmental conditions. The experiments planned in Aim 1 will establish the relationship between environmental stresses and the changes in size and balance of the cellular dNTP pool. Stress factors will comprise the currently used drugs against tuberculosis, as well. The mathematical model of dNTP metabolism to be created in Aim 2 will be used to predict dNTP pool changes and to simulate the effects of stress factors. Using the model, we will be able to pinpoint the master regulators and weak points of the biological network, which may help drug design, and the management of current drugs. The experiments planned in Aim 3 will reveal the mutational pattern and DNA repair induction pathways in function of dNTP pool imbalances and expansion upon stress exposure. Finally, the results of Aims 1-3 in concert will shine light on the mechanistic reasons for a fine tuned cellular dNTP balance and the consequences of imbalance. The results will help to understand how dNTP pool changes possibly promote drug resistance, an instance of adaptation to genotoxic stress in mycobacteria comprising Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Tuberculosis is as a worldwide health threat due to the massive spreading of drug resistant strains. Drug resistance often occurs via horizontal gene transfer. However in mycobacteria, including the causative agent of tuberculosis, drug resistance emerges mainly via single-base mutations. As the basic mutation rate in mycobacteria is low, external factors, including the genotoxic stress upon drug administration, may induce a higher rate of mutations as adaptation to the genotoxic stress. The investigation of mutation-inducing mechanisms will therefore lead to a possible better management of drug resistance and of current combination therapies. From a basic research point of view, systematic studies on dNTP pool regulation linking endogenous and environmental stresses to dNTP pool changes and in turn to DNA repair are missing. Our knowledge has only recently been expanded on new roles of dNTP pool homeostasis including defense against HIV infections, cell cycle control, oncogenic progression and aging. It is of great interest to reveal the mechanisms by which the simple concentration relations of DNA building blocks lead to complex phenomena determining life and death of a cell.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Cells maintain a definite pool of the nucleotide building blocks of their genome. The regulation of this pool has recently been proposed to influence complex phenomena including defense against HIV infections, oncogenic progression and aging. Our hypothesis is that nucleotide pool regulation is also related to the emergence of drug resistance in tuberculosis bacteria. Tuberculosis remains a worldwide health issue due to the massive spreading of drug resistant strains. Our goal is to offer a mechanism by which current tuberculosis drugs induce mutations leading to resistance. We wish to do that via a systematic investigation starting out with various stress exposures to the analysis of the induced mutations. We use a non-pathogenic model, a close relative to the causative agent of tuberculosis, to carry out our investigations. We will apply various environmental stresses including the currently used tuberculosis drugs on the model bacteria. We will then measure the changes elicited in their nucleotide pool. We will construct a mathematical model including the nucleotide pool data and a set of biochemical reactions composing the biosynthesis of the DNA building blocks. This mathematical model can be used to predict the behavior of the biological system in various conditions and may possibly help in the management of current drug combination therapies. Finally, we will analyze the mutations induced by the environmental factors and nucleotide pool changes with the expectation that the analysis will shine light on the mechanisms leading to drug resistance.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
A Mycobacterium tuberculosisnak és más, intracelluláris kórokozóknak adaptív stratégiákra van szükségük az immunválasz és az antibiotikumkezelés részeként fellépő genotoxikus környezethez való alkalmazkodásban. A mikobaktériumokban az in vitro mutációs ráta nagyon alacsony, azonban a betegekből származó izolátumok akár több gyógyszerrezisztens törzset is tartalmazhatnak. Ez az eltérés azt sugallta, hogy a gazdaszervezetben ható stressz faktorok megnövekedett mutációs rátát idézhetnek elő, ismeretlen mechanizmusok révén. Ezt a jelenséget vizsgáltuk a potenciális genotoxikus stresszfaktorok in vitro modellezésével. Elemeztük a DNS prekurzorok (dNTP) készletét, a DNS-javító útvonalak aktiválódását, valamint a teljes genom mutációs rátáját és mintázatát stresszkezelt sejtekben. Felépítettük a dNTP bioszintézis kinetikai modelljét is, hogy a dNTP anyagcserét célzó gyógyszerek hatása megjósolható legyen a sejtnövekedésre. A projekt egyik legérdekesebb eredménye az, hogy az elsővonalbeli antituberkulotikumok kombinációban alkalmazva, akárcsak a valós terápiában, szokatlanul sok mutációt indukálnak egymáshoz közel. Ugyanakkor a hibára hajlamos polimeráz expressziója is nő. Azt gondoljuk, hogy a gyógyszerkezelés DNS-károsodást okoz, amelyet „long-patch” hibára hajlamos DNS javító mechanizmus kezel mutációkat létrehozva egy, a kezelés alatt nyugvó polulációban. A gyógyszeres kezelés megszakításakor jelentős szerepet játszhat ez a mechanizmus az antibiotikum-rezisztencia kialakulásában.
kutatási eredmények (angolul)
Mycobacterium tuberculosis and other intracellular pathogens are exposed to harsh conditions as part of the immune response and of antibiotics treatments. These bacteria need to develop strategies for the adaptation to genotoxic environments. The basal mutation rate in mycobacteria is low in vitro, however, isolates from patients display high genomic diversity, including several different drug resistant strains in one sample. This discrepancy suggested that stress factors within the host may elicit increased mutation rates by unknown mechanisms. We investigated this phenomenon by mimicking potentially genotoxic stresses in vitro. We analyzed the pools of DNA precursors (dNTP), the activation of DNA repair enzymes and the mutation rate and pattern of the whole genome in stress-treated cells. We also built kinetic models of dNTP biosynthesis so that the effect of a drug targeting dNTP metabolism can be predicted on cell growth. One of the most intriguing outcomes of the project is that first-line antituberculosis drugs applied in combination, as in real therapy, induce un unusually high number of mutations spatially close to each other. This phenomenon coincides with the upregulation of the major error-prone polymerase. We propose a mechanism whereby DNA damage upon drug treatment induces long-patch error-prone DNA repair. We attribute great importance to this phenomenon as having major role in antibiotic resistance development upon the interruption of drug treatments.
