Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet (Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ)
projekt kezdete
2016-01-01
projekt vége
2018-12-31
aktuális összeg (MFt)
24.000
FTE (kutatóév egyenérték)
2.40
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A növényi vírusok rendkívül változatos tüneteket és gyakran komoly gazdasági károkat okoznak az eltérő gazdanövényeken, ennek ellenére mégis keveset tudunk e tünetek mögött meghúzódó molekuláris mechanizmusokról. A növények a vírusfertőzésekkel szemben főleg RNS csendesítéssel (RNAi) védekeznek. Ennek során a vírus replikációs intermedierjét a növényi DCL enzimek 21-24 nt RNS-ekre (vsiRNS) vágják. Ezek a vsiRNS-ek ezután beépülnek egy AGO komplexbe, amely további vírus RNS-eket képes lebontani. A vírusok erre válaszul olyan RNAi szuppresszorokat fejlesztettek ki, amelyek képesek a növény RNAi rendszerének a működését gátolni. Az RNAi-nak nem csak a patogének elleni védekezésben, hanem az endogén gének szabályozásában is fontos szerepe van. Az endogén kis RNS-ek részt vesznek a fejlődési folyamatok és a stressz válasz szabályozásában. A növényi kis RNS–ek keletkezésük módjától függően: siRNS-ek és miRNS-ek lehetnek. Kísérleti rendszerünkben az uborka mozaik vírus (CMV) két izolátomát használjuk: az Nt-CMV izolátum paradicsom növényeken mozaikos tüneteket; a ScL-CMV súlyos a levélszimmetria elvesztésével járó tünetek okoz és a levelek fonalszerűek lesznek. Ez a tünet nagyon hasonlít egy RNAi mutáns (rdr6) paradicsom fenotípusához. Az RDR6 gén terméke szükséges a transz-ható siRNS-ek képződéséhez. Ezek alapján felvetődik annak a lehetősége, hogy a növény kis RNS-ekkel szabályozott folyamataiba avatkozik be a vírus, és ez állhat a ScL-CMV által okozott tünetek hátterében. Pályázatunkban azt vizsgáljuk, hogy a különböző tüneteket okozó vírus izolátumok, milyen gén expressziós változásokat okoznak, illetve hogyan befolyásolják a növény endogén kis RNS-einek a szabályozását.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A növények folyamatos fegyverkezési versenyben állnak az őket támadó vírusokkal. A növény képes érzékelni a vírus replikáció során keletkező dupla szálú RNS molekulákat és RNS csendesítő mechanizmusa segítségével lebontja ezeket, illetve a vele azonos szekvenciájú vírus RNS-eket, amely folyamat során kisméretű RNS molekulák (21-24nukleotid) keletkeznek. A növényekben különböző RNS csendesítési utakon szintén keletkeznek kisméretű nem kódoló RNS molekulák. Ezeknek az endogén kis RNS-eknek alapvető szerepe van a növényi fejlődés, fiziológiai folyamatok és stresszekkel szembeni védekezőképesség szabályozásában. Vírusfertőzéskor a víruseredetű kisRNS-ek illetve a vírus RNS csendesítés szuppresszora kölcsönhatásba kerülhetnek a gazdanövény endogén kisRNS-ek keletkezési útvonalaival, illetve az általuk szabályozott mRNS-kel és befolyásolhatják azok expresszióját. Az uborka mozaik vírus (CMV) két izolátuma gyökeresen eltérő tüneteket okoz paradicsomon. A ScL-CMV levélszimmetria vesztéssel járó fonalszerű leveleket, míg az Nt-CMV mozaikosságot okoz. Kutatásunk alapkérdése, hogy mi az oka ennek a különbségnek és pontosan milyen molekuláris folyamatok okozzák a fonalszerű levelek kialakulását. Valószínűsíthető, hogy a vírus, a növény endogén kis RNS szabályozására vagy azok target mRNS-eire hat, megváltoztatva ezzel a levélfejlődés folyamatát. Ugyanakkor fontos vizsgálnunk a vírus oldalát is, miben más a két izolátum szekvencia szinten, és ez hogyan járul hozzá az eltérő tünetek kialakulásához. A két eltérő tüneteket okozó vírus izolátum vizsgálata növény és vírus oldaláról lehetőséget teremthet arra, hogy bővüljenek ismereteink a vírustünetek kialakulásának molekuláris hátteréről.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A növények vírusfertőzése során különböző típusú és súlyosságú tünetek alakulhatnak ki, amelyek sokszor jelentősen csökkentik a termésmennyiséget is. Annak ellenére, hogy nagy erőkkel dolgoznak e témán, keveset tudunk arról, hogy a tünetek hátterében milyen molekuláris mechanizmusok állnak. Ha megértenénk a tünet kialakulás folyamatát, akkor lehetőség nyílna arra, hogy mérsékeljük a vírustünetek súlyosságát. Napjaink egyik legintenzívebben kutatott tudományterülete a kisRNS-ek magasabb rendű szervezetekben betöltött szabályozási szerepének vizsgálata. Ismert, hogyan szabályozzák az endogén kis RNS-ek a növények fejlődését, fiziológiai folyamatait, stressz válaszait. A vírusfertőzés során a vírus genomról is keletkeznek virális kisRNS-ek (vsiRNS) ezek kialakulásáról és a vírus genomra gyakorolt hatásairól is sok ismeretünk van. Azonban, vírusfertőzéskor a vsiRNS-ek, a vírus RNS csendesítés szuppresszora, illetve egyéb vírus fehérjék kölcsönhatásba kerülhetnek a növény endogén kisRNS-ek keletkezési útvonalaival, illetve az általuk szabályozott mRNS-kel és befolyásolhatják azok hatását és expresszióját. Kísérleti rendszerünkben az uborka mozaik vírus (CMV) két izolátomát használjuk: az Nt-CMV izolátum paradicsom növényeken mozaikos tüneteket; a ScL-CMV súlyos a levélszimmetria elvesztésével járó tünetek okoz, és ezért a levelek fonalszerűek lesznek. Új generációs szekvenálás és nagy áteresztőképességű technikák alkalmazásával (RNS-seq könyvtárat készítünk) illetve kandidáns gén megközelítéssel (a levélfejlődésben résztvevő útvonalak vizsgálata) fogjuk az ScL-CMV tünetek hátterében levő molekuláris folyamatokat feltárni. Ha sikerül megértenünk, hogy milyen virális gének vagy vírus eredetű kisRNS-ek felelősek a súlyos levélfejlődési rendellenességek kialakulásáért, illetve ezek hogyan befolyásolják az endogén mRNS-ek és kisRNS-ek expresszióját, akkor olyan új ismeretekre tehetünk szert, amelyek alkalmazhatóak lesznek a növénynemesítésben a vírusokkal szembeni új típusú védekezések kialakítására. Továbbá a kutatás során szerzett ismeretek felhasználhatóak lesznek olyan betegség ellenálló növények kialakítására, amelyeknél jelentősen csökken a vírusfertőzések hatására kialakuló termésveszteség.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A 21. század egyik legfontosabb kérdése, hogy miként tudunk elegendő élelmiszert előállítani a Föld egyre növekvő népességének. A népesség továbbra is folyamatosan gyarapszik és a becslések szerint 2050-re eléri a 9 milliárdot. Mivel az élelmiszertermelésre fordítható földterületek mérete tovább már nem növelhető, az élelmiszerbiztonság megőrzése csak úgy biztosítható, ha növeljük a termésátlagokat és ezzel egy időben csökkentjük a termésveszteségeket is. A vírusok által okozott termésveszteségek jelentősek. Annak ellenére, hogy széles ismeretekkel rendelkezünk a vírusokról és az általuk, okozott tünet típusokról, sajnos a tünetek kialakulásáért felelős molekuláris mechanizmusok még ma sem ismertek széles körűen. Az uborka mozaik vírus (CMV) az egyik legszélesebb gazdakörrel rendelkező patogén - több mint 1200 fajt képes fertőzni - komoly károkat okozva ezáltal a mezőgazdaság számára. A CMV különböző izolátumai egymástól eltérő súlyosságú levélfejlődési rendellenességet okoznak paradicsomon. Az Nt-CMV mozaikos foltokat, míg a ScL-CMV súlyos a levél szimmetria elvesztésével járó fejlődési rendellenességet okoz, aminek a következtében a növény levelei fonalszerűek lesznek. Az elmúlt évek során vált ismertté, hogy a rövid nem kódoló RNS (kisRNS) molekuláknak fontos szerepe van a növény fejlődési folyamatainak kialakításában és ez által a levélfejlődés szabályozásában is. Pályázatunkban azt vizsgáljuk, hogy a különböző tüneteket okozó vírus izolátumok, milyen gén expressziós változásokat okoznak, illetve hogyan befolyásolják a növény endogén kis RNS-einek a szabályozását. A kutatás során szerzett ismeretek felhasználhatóak lesznek betegség ellenálló növények nemesítésére.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Symptoms caused by plant viruses are responsible for remarkable crop losses. The molecular background of virus-induced disease symptoms have been extensively studied but poorly understood so far. In plants RNA silencing (RNAi) is a natural defence mechanism against invading viruses. During this process the replication intermediers of viruses are diced by plant DCL enzyme to 21-24 nt RNA (vsiRNA). VsiRNAs incorporates into AGO complex and this complex can cleave further virus RNAs. As a response to this defence system viruses has developed silencing suppressors which repress the plant RNA silencing system. RNAi have a role not only in the defence against pathogen infection but also in the regulation of plant endogenous genes. Endogenous siRNA are involved in developmental processes and regulation of stress response. Plant small RNAs have two groups depending on their biogenesis: siRNAs and miRNAs. In our experimental system we will use two isolates of cucumber mosaic virus (CMV): Nt-CMV causes mosaic symptoms and ScL-CMV infection causes serious leaf developmental abnormalities, called shoestring symptoms. This symptom is very similar to the phenotype of an RNAi mutant (rdr6) tomato. The gene product of RDR6 is essential for the production of trans-acting siRNAs. Based on these facts there is a possibility that the virus interfere with the plant endogenous small RNA system or with the expression of leaf polarity genes and may be this lay behind the background of symptoms caused by ScL-CMV. In our research proposal we analyse the gene expression patterns, changes in endogen small RNAs regulation caused by two different virus isolates.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. There is an evolutionary arms race between plants and viruses. Plants are able to sense the double-stranded RNA molecules derived from the replication intermediers of the invading virus and dice them with DCL enzymes during the RNA silencing based plant defence. During the silencing process small RNA molecules (21-24 nt siRNAs) are generated. These siRNAs can incorporate into AGO complexes and can target complementer sequences for degradation. In plants small non-coding RNA molecules can also derive from different endogenous RNA silencing pathways. These endogenous small RNAs have an important role in regulation of plant development, physiological processes and stress tolerance. During virus infection, virus derived small RNAs or RNA silencing suppressor of the virus can interact with host endogenous small RNA pathways and with mRNAs regulated by these pathways and modify their expression. Two isolates of cucumber mosaic virus (CMV) cause dramatically different symptoms on tomato. Infection with ScL-CMV, tomato leaves show serious developmental abnormalities, called shoestring symptoms, while Nt-CMV cause mosaic symptoms. In this project we propose to investigate the molecular background of shoestring symptom development. We hypothesize that the virus interacts with the plant endogenous small RNA system or with its’ target mRNA. We also offer to study the virus side of the interaction, to see what the difference between the two isolates on sequence level is and how it is contributing to symptom development. Studying of two different virus isolates can give possibilities to elucidate the molecular mechanism behind the symptom.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Virus infected plants display various symptoms with different type and severity and these symptoms can reduce the crop yields enormously. Although the molecular mechanisms behind the virus induced disease symptoms are in the focus of many research groups, however the process still poorly understood. If we can understand the molecular basis of symptom development it would be possible to reduce the severity of the virus symptoms. In recent years smallRNA signalling pathways are very intensively studied. We have a lot of information about how the endogenous smallRNAs regulate plant development, physiological processes and stress responses. During infection, viral smallRNAs (vsiRNA) are generated from the viral genome. We have a lot of information about the production of vsiRNAs and its effects on the virus genome. VsiRNAs, viral silencing suppressors and other virus proteins can interact with the plant endogenous smallRNA pathways and with mRNAs regulated by these pathways and modify their expression. In our experimental system we will use two isolates of cucumber mosaic virus (CMV): Nt-CMV causes mosaic symptoms and ScL-CMV causes serious leaf developmental abnormalities (called shoestring symptoms).We offer to study the molecular background of ScL-CMV symptoms using next generation sequencing (RNA-seq), and we will also use candidate gene approach (analysing the signal transduction pathways involved in leaf development), respectively. We will try to understand what kind of viral genes and virus derived smallRNAs are responsible for the serious leaf developmental abnormalities and how do they influence the expression pattern of endogenous mRNAs and smallRNAs. The findings of the project proposed, could be applied in plant breeding to make virus resistant or tolerant crops and crop losses due to severe symptoms may be reduced.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. One of the most important questions of this century is to produce enough food for the people on our planet. The population is growing rapidly and it is projected to reach 9 billion by 2050. The available area for food production is limited so we have to increase the crop yields and at the same time reduce the yield losses. The yield losses caused by viruses are remarkable. Although we have a lot of information about viruses and the symptom types they cause, unfortunately the molecular background of virus-induced disease symptoms are poorly understood. The cucumber mosaic virus (CMV) has very likely the broadest host range among viruses- it can infect more than 1200 species- and it can enormously reduce the crop yields. Different isolates of CMV cause absolutely different leaf developmental symptoms on infected tomato plants. Nt-CMV causes mosaic symptoms and ScL-CMV causes serious leaf developmental abnormalities (called shoestring symptoms). It became clear in recent years, that small non-coding RNAs have an important role in plant developmental processes including leaf development. In this project we will analyse the gene expression patterns, changes in endogen small RNAs regulation caused by the two different virus isolates. The new results of the proposed project can be applied for breeding of pathogen resistant plants.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
Az intenzív kutatás ellenére a növényi vírusok által okozott tünetek molekuláris hátteréről kevés ismerettel rendelkezünk. Kísérleti rendszerünkben az uborka mozaik vírus (CMV) két izolátumát használtuk: a Trk7-CMV izolátum paradicsom növényeken enyhe mozaikos, az ScL-CMV súlyos, a levélszimmetria elvesztésével járó tünetek okoz, a levelek fonalszerűek lesznek. Ezen két vírustörzsből rekombinánsokat és reasszortánsokat hoztunk létre, ezek által okozott tünetek vizsgálata alapján elmondható, hogy az ScL-CMV 2b silencing szupresszora felelős a fonalszerű levél tünet kialakulásáért. További vizsgálatokból kiderült, hogy a 2b fehérjének a 14. és a 35. aminosava fontos a tünet kialakításhoz. A fonalszerű levél tünet nagyon hasonlít egy RNAi mutáns (rdr6) paradicsom fenotípusához. Az RDR6 gén terméke szükséges a ta-siRNS-ek képződéséhez. Lehetséges, hogy a növény kis RNS-ekkel szabályozott folyamataiba avatkozik be a vírus, és ez állhat a ScL-CMV által okozott tünetek hátterében. Kimutattuk, hogy az ScL-CMV-vel fertőzött paradicsom növényekben a tünet kialakulását követően a tasiR-ARF-ok mennyisége lecsökkent, a tasiR-ARF-ok által szabályozott AFR4 expressziója pedig jelentősen megemelkedett enyhe tünetet mutató Trk7-CMV-vel fertőzött paradicsom levélhez képest. Kutatásaink alapján úgy gondoljuk, hogy ScL-CMV 2b gátolja a tasiR-ARF-ok keletkezését, ezért azok nem képesek gátolni az ARF4 expressziót, ami levél szimmetria változását okozza és kialakul a fonalszerű levél.
kutatási eredmények (angolul)
Molecular background of virus induced disease symptoms have been extensively studied but still poorly understood. Two cucumber mosaic virus (CMV) strains are especially suitable for studying this phenomenon. ScL-CMV and Trk7-CMV strains show high degree of sequence similarity, ScL-CMV causes severe shoestring symptoms on tomato which means plant leaves are extremely narrow and Trk7-CMV strain causes mild mosaic symptoms. Analysing reassortants and recombinants of Trk7-CMV and ScL-CMV we identified the 2b silencing suppressor of ScL-CMV is responsible for shoestring symptom. Trk7-CMV and ScL-CMV silencing suppressors are very similar, only three amino acid differences were identified at position 14, 35 and 81. Based on our results 14. and 35. amino acids are important for the symptom development. Shoestring symptom is very similar to the phenotype of an RNAi mutant (rdr6) tomato. The gene product of RDR6 is essential for the production of ta-siRNAs. There is a possibility that the virus interfere with the plant endogenous small RNA system. We found tasiR-ARF4 level was decreased, ARF4 was elevated in ScL-CMV infected tomato compared to the Trk7-CMV which causes mild symptoms. Based on our studies we believe that the ScL-CMV 2b inhibit the production of tasiR-ARFs therefore they are not able to repress ARF4 and results in abnormal leaf development.
Tóth Tamás, Sós-Hegedűs Anita , Nemes Katalin , Gyula Péter , Salamon Pál , Salánki Katalin és Szittya György.: Vírusfertőzés következtében kialakuló levélmorfológiai változás molekuláris hátterének vizsgálata., http://www.magyarnovenyvedelmitarsasag.hu/64NTN/NTN64Kiadvany.pdf, 2018
Sós-Hegedűs A, Domonkos Á, Tóth T, Gyula P, Kaló P, Szittya G.: Suppression of NB‐LRR Genes by miRNAs Promotes Nitrogen‐fixing Nodule Development in Medicago truncatula., Plant Cell Environ. 2019 Dec 13. doi: 10.1111/pce.13698 , 2019
Sós-Hegedűs A., Salamon P., Nemes K., Salánki K., Szittya G: Analysis of molecular background of leaf developmental abnormality caused by virus infection, Hungarian Molecular Life Sciences 2017, 31 March – 2 April 2017, Eger (Programme & Book of abstracts, 223. oldal. ISBN 978-615-5270-34-5) poszter, 2017
Sós-Hegedűs A, Nemes K, Tóth T, Gyula P, Salamon P, Salánki K, Szittya G.: Molecular background of virus induced leaf developmental abnormality., IGC Symposium 2017 on Plant RNA Biology, 27-28 September 2017, (Abstract Book 59.o.) Oeiras, Portugal. poszter, 2017
