 |
A stabil másodlagos struktúrával rendelkező DNS szakaszok replikációjának biokémiai vizsgálata
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
119361 |
| típus |
K |
| Vezető kutató |
Burkovics Péter |
| magyar cím |
A stabil másodlagos struktúrával rendelkező DNS szakaszok replikációjának biokémiai vizsgálata |
| Angol cím |
Biochemical analysis of the replication of stable secondary structure-forming DNA sequences |
| magyar kulcsszavak |
replikáció, G quadruplex, trinukleotid ismétlődések, onkogén transzformáció |
| angol kulcsszavak |
replication, G quadruplex strucuters, trinucleotide repeats, oncogenic transformation |
| megadott besorolás |
| Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 90 % | | Ortelius tudományág: Biokémia | | Molekuláris genetika, reverz genetika, RNS-interferencia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 10 % | | Ortelius tudományág: Molekuláris genetika |
|
| zsűri |
Orvosi és Biológiai Tudományi zsűrielnökök |
| Kutatóhely |
Genetikai Intézet (HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont) |
| résztvevők |
Fajka Boja Roberta
Körmöcziné Dr. Sajben-Nagy Enikő Ilona
Tóth Ágnes
|
| projekt kezdete |
2016-12-01 |
| projekt vége |
2021-11-30 |
| aktuális összeg (MFt) |
47.971 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
6.38 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A humán genom jelentős részét alkotják olyan DNS szekvenciák, amelyek egyes szálú formában stabil másodlagos szerkezetet képesek felvenni, így képesek a replikációt blokkolni. Pályázatunkban két speciális struktúrára fókuszálunk: a G quadruplexekre (G4) és a trinukleotid repeat-ek (TNR) által formált hurkokra. E szekvenciák másolása egyrészt kihívás a sejt számára, másrészt elengedhetetlen, speciális funkciójuk megőrzése miatt, mivel a G4 struktúráknak fontos szabályozó szerepük van a kromoszómavégek védelmében (telomer), a génexpresszió szabályozásában transzkripciós vagy transzlációs represszióval és a kromoszóma-kondenzáció meghatározásában. Ezenfelül a TNR hosszának növekedése felelős mintegy 40 különböző neurodegeneratív betegség kialakulásáért, míg a G4 struktúra megszűnése lehet az onkogén aktiváció és a rák kialakulásának egyik lehetséges kiváltója, mivel az onkogének promoter és 5’ UTR régiójában gyakoriak a potenciális G4 szerkezetet felvenni képes szekvenciák. A fő kérdés, amelyre választ keresünk az az, hogy hogyan alakulnak ki ezek a betegségeket okozó replikációs hibák. A replikatív DNS polimerázok egyedül nem képesek megküzdeni e szekvenciák másolásával, ezért ehhez számos fehérje segítségét kell igénybe venniük. Bár több fehérjéről kimutatták, hogy szerepe lehet e struktúrák másolásában, az alig ismert, hogy hogyan hatnak a DNS polimerázok működésére. Ezért munkánk során szeretnénk in vitro létrehozni e struktúrák replikációjának modelljét DNS szubsztárok és tisztított fehérjék segítségével, amellyel megvizsgálhatjuk, hogy a különböző fehérjék hogyan hatnak a DNS polimerázok működésére, hogyan biztosítják a blokkoló szekvenciák pontos másolását.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A különböző stabil másodlagos struktúrákat felvenni képes DNS szakaszok, mint például a G quadruplex (G4) és trinukleotid repeat (TNR) hurkok replikációja kiemelten fontos a sejtek számára, mivel ezek hibás másolása onkogén aktivációt, így tumoros elváltozást, illetve számos különböző neurodegeneratív betegséget pl. Huntington-kórt okozhat. Éppen ezért a központi felvetésünk az, hogy a replikációt végző DNS polimerázok és az őket ezeken a blokkoló struktúrákon átsegítő fehérjék együttműködésének megbomlása felelős a hibás másolásért, ami az onkogén aktivációt és így rákos elváltozást (G4), vagy a súlyos neurodegeneratív betegségek kialakulását (TNR expanzió) okozza. Ezért a következő fő kérdéseket vizsgáljuk meg: 1. In vitro modellezzük a G4 és a TNR hurok struktúrák replikációját modell DNS szubsztrátokkal és tisztított élesztő és emberi fehérjékkel. Ehhez kapcsolódóan szeretnénk tisztítani és jellemezni az emberi DNS polimeráz ε-t, amelynek biokémiai jellemzői alig ismertek, bár in vivo szerepe nagyon jelentős, többek között e blokkoló struktúrák replikációjában. A DNS polimeráz ε tisztítása és jellemzése roppant fontos mind a blokkoló struktúrák, mind az általános replikációs mechanizmus megértésben. 2. Megvizsgáljuk az együttműködő fehérjék DNS polimerázokra gyakorolt hatását a felállított modell rendszerekben. Korábbi kísérleteinkben azonosítottunk két együttműködő fehérjét (RTEL1 és WRNIP1), melyek módosíthatják a DNS polimerázok aktivitását. 3. In vivo riporter rendszereket készítünk, melyekkel bizonyíthatjuk a biokémiai kísérletek eredményének in vivo jelentőségét, valamint ezekkel a rendszerekkel további részt vevő fehérjéket azonosítsa válik lehetővé.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Sejtjeinknek alapvető fontosságú, hogy minél pontosabban másolják a genetikai információt. Különösen nehéz kihívás bizonyos stabil másodlagos szerkezettel rendelkező DNS szekvenciák, úgymint a G quadruplexek (G4) és a trinukleotid repeat-ek (TNR) által formált hurkok másolása, mivel ezek maguk képesek blokkolni a replikáció folyamatát. Az emberi genom több mint 360 000 potenciális G4 szekvenciát tartalmaz, amelyek számos alapvető funkció szabályozásában vesznek részt, úgymint: onkogének transzkripciós és transzlációs represszálása, a replikáció iniciációja (kijelölik a replikációs origó helyét; az emberi replikációs origók 67%-a G4 szekvencia közelében helyezkedik el), az IgG molekulák rekombinációjának fontos tényezői, meghatározzák a kromoszóma kondenzációt és a rajtuk lévő epigenetikus markereket. A legjobban ismert G4 struktúrák természetesen a kromoszómavégek stabilitását biztosító telomerek, ezért a G4 szekvenciáknak az öregedés folyamatában is szerepe lehet. Amennyiben a G4 struktúrák replikációja valamilyen hiba miatt lelassul, akkor ez a másolt DNS szakasz epigenetikus markereinek megváltozásához vezet. A hibás másolás pedig az adott G4 szerkezet fellazulásához/elvesztéséhez vezethet, ami miatt az többé nem tudja megfelelően ellátni szabályozó funkcióját, és végzetes következményként például onkogén aktiválódás jöhet létre. A TNR hurkok hibás másolása, pontosabban azok expanziója miatt több mint 40 különböző neurodegeneratív betegség alakulhat ki, melyek egyik legismertebb képviselője a Huntington-kór. Elsődleges célunk annak a biokémiai folyamatnak a megértése, melynek során különböző együttműködő partnerek segítik a replikációt végző DNS polimerázokat a stabil másodlagos struktúrával rendelkező DNS szakaszok átírásában. Ezáltal jobban megérthetjük, hogy milyen biokémiai mechanizmusok vezetnek az onkogén aktivációhoz, mely minden tumorképződés motorja. A TRN hurkok vizsgálatával pedig feltárhatjuk a súlyos neurodegeneratív betegségek kialakulásának biokémiai mechanizmusát, és közelebb juthatunk e betegségek kialakulásának megelőzéséhez.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Sejtjeink folyamatosan osztódnak, a genetikai információ hibás másolása azonban súlyos problémákhoz vezethet. Az ivarsejtek keletkezése során bekövetkező genetikai változások örökletes betegségekhez, míg a testi sejtek osztódása során bekövetkezett változások rákos elfajuláshoz vagy egy szerv működési zavarához vezethetnek. Ezért szükséges, hogy sejtjeink maximális pontossággal másolják a DNS-t. Annak ellenére, hogy a DNS másolásának pontossága ilyen fontos, számos olyan szekvencia fordul elő az emberi genomban, amelyek a replikáció során stabil másodlagos szerkezetet vehetnek föl, gátolva a DNS másolását. Az egyik leggyakoribb ilyen szekvenciát G quadruplexnek (G4) nevezik, amelyből számítógépes analízissel több, mint 360 000 darabot találtak az emberi genomban. Az utóbbi időben egyre többet tudunk meg a G4 struktúrákról: fontos szerepet töltenek be például az onkogének csöndesítésében. Az onkogének olyan fehérjék, melyek túlműködése rákos elváltozást okoz. Munkánk során azt vizsgáljuk, hogy mely fehérjék és hogyan hatnak a G4 szekvenciák másolására, mi vezet az onkogéneket aktiváló hibás másoláshoz, ami az első lépés a rákos megbetegedés kialakulásában. Más nehezen átíródó struktúrákat is vizsgálni szeretnénk, melyek közül a legfontosabbak a trinukleotid repeatek (TNR) által formált hurkok. Ezek azért jelentősek, mert több mint 40 különböző neurodegeneratív betegség (pl. a Huntington-kór) kialakulásának oka a TNR szekvenciák hibás másolása. Munkánk sikeres kivitelezése esetén lényeges új információkat tudhatunk meg e súlyos betegségek kialakulásának mechanizmusáról, ami lehetővé teszi új gyógyszercélpontok azonosítását is.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
There is a huge number of special DNA sequences present in the human genome that can form stable secondary structures in single-stranded forms and behave as replication blockades. In our proposal, we plan to concentrate on two different blocking structures. One of them is the G quadruplex (G4), and the other is the trinucleotide repeat (TNR), which forms a stable loop structure. The accurate replication of these sequences is both a challenge and a necessity for the cell because G4 structures have various essential functions such as ensuring the stability of the ends of the chromosomes (telomeres), replication initiation, gene expression regulation by transcription and translation repression, and determination of chromosome condensation. Additionally, TNR repeat expansion is responsible for about 40 different neurodegenerative diseases and, theoretically, the loss of G4 structures may lead to oncogene activation and carcinogenesis as the promoter and 5’ UTR regions of oncogenes are rich in potentially G4-forming sequences. Therefore, our major goal is to understand how the action of replicative DNA polymerases leads to these failures. DNA polymerases alone cannot cope with the challenge of replicating blocking sequences, therefore, the contribution of several other proteins is needed. Although several contributors have been identified, it is still not clear how they affect the biochemical activity of DNA polymerases. Therefore, we will reconstitute in vitro a replication model of these structures and analyze how the different contributor proteins modify the biochemical activity of DNA polymerases enabling correct replication of the G4 and TNR sequences.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The accurate replication of special DNA structures such as G quadruplexes (G4) and trinucleotide repeats (TNR) is an essential role of the cell because its failure results in oncogenic activation, cancer progression, or serious neurodegenerative disorders such as Huntington’s disease and about 40 other diseases. Therefore, our central hypothesis is that the disrupted cooperation between DNA polymerases and their helper proteins results in inaccurate replication of these special DNA structures, which causes oncogene activation or TNR expansion. Our major goals are the following: 1. In vitro reconstitution of the replication of the G4 and TNR structures using human or yeast purified proteins. Human DNA polymerase ε is an important and poorly characterized replicative DNA polymerase, which definitely has an important role in the replication of these blocking sequences, therefore, its purification and basic characterization is an important step in understanding how replication in human cells goes on in general and in the special case of G4 and TNR sequences. 2. Analysing the effects of the cooperating proteins. In our recent work, we identified two possible cooperators (RTEL1 and WRNIP1) that modify the activity of DNA polymerases. 3. We will create in vivo reporter systems both in yeast and human cells to verify our biochemical findings and enable in vivo screening for novel candidates.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The accurate replication of stable secondary structure-forming DNA sequences such as G quadruplexes (G4) or trinucleotide repeats (TNR) is an important challenge for the dividing cell, because failure in the replication of these sequences may result in serious complications. In the human genome, there are over 360 000 potential G4-forming sequences, which have a large variety of functions such as transcriptional or translational repression of oncogenes, contribution to replication initiation, having a role in IgG class switch recombination, contributing to chromosome structure formation, and the formation of different epigenetic markers as well as ensuring the stability of chromosome ends. The most well-studied G4 structures are the telomeres, which suggests a function for G4 sequences in the processes of aging. Slow replication of G4 may lead to changes in the epigenetic markers on the given part of the DNA, and inaccurate replication may result in the loss of the regulatory function of the G4 sequence, which could induce fatal changes such as oncogene activation in the cell. Inaccurate replication of TNR results in its expansion, which is the cause of about 40 different neurodegenerative diseases such as Huntington’s disease. Our current goal is to achieve a better understanding of the biochemical relationship between replicative DNA polymerases and the blocking structure-resolving cooperator proteins to shed light on how oncogene activation takes place or how trinucleotide repeat expansion-mediated neurodegenerative diseases are formed. We believe that based on this work we will be able to reveal how these serious diseases are initiated and, therefore, how their formation can be prevented.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Cell division is potentially dangerous because inaccurate copying (replication) of the genetic data may cause serious problems. Replication failure in the forming gamete may lead to hereditary diseases. Erroneous replication in somatic cells could lead to tumor formation or organ dysfunction. Therefore, it is essential to ensure the highest possible fidelity of this process. Normally, replication is performed by replicative DNA polymerases, which are high-fidelity enzymes. Surprisingly, there are several sequences in the human genome that are able to form stable secondary structures during the replication process, inducing a replication blockade. One such typical form is the so-called G quadruplex (G4). Bioinformatical prediction suggest that more the 360 000 potential G4 forming sequences are present in the human genome. Very recently, more and more data demonstrate that these sequences have important functions; one of the most important could be the transcriptional and translational repression of oncogenes. Oncogenes are special proteins which, when overproduced, lead to oncogenic transformation and cancer development. In our project, we examine how these G4 structures are replicated and which proteins contribute to their inaccurate replication resulting in oncogene activation and promotion of cancer development. Additionally, we also analyze other DNA structures such as trinucleotide repeat loops whose expansion is responsible for over 40 different neurodegenerative diseases. Finally, this work will provide a better understanding of how these serious diseases develop, and this knowledge may lead to new drug targets.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
