Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet (Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ)
projekt kezdete
2016-10-01
projekt vége
2019-09-30
aktuális összeg (MFt)
15.087
FTE (kutatóév egyenérték)
2.10
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. Kutatócsoportunk Sleeping Beauty transzpozíció alkalmazásával transzgénikus nyúl vonalat hozott létre (Katter és mtsai, 2013). A transzgénikus nyulak a zöld Venus fluoreszcens fehérjét expresszálják, ami UV megvilágítás esetén válik láthatóvá. A Venus protein az Aequorea victoria medúzában korábban azonosított GFP fehérje (green fluorescent protein) egyik változata. A genetikailag módosított nyulaink egyik nagy előnye, hogy a rekombináns fehérje előfordulása nem korlátozódik specifikus szövetekre, hanem minden szervben kifejeződik. Legfrissebb kutatásaink során sikerült kimutatnunk a Venus fehérjét érett spermiumokban és hereszövetben is (Hoffmann és mtsai, 2016, elbírálás alatt). Ezt az expressziós mintázatot a chicken ß-actin promotert, cytomegalovirus enhancert (CAGGS) és a Venus riporter gént tartalmazó transzgénikus konstrukció biztosítja. A transzgénikus állományt homozigóta és heterozigóta vonalként is sikerült fenntartani. A fluoreszcens Venus fehérje jelenléte fluoreszcens mikroszkópia, microplate reader, áramlásai citometria (flow cytometry); a transzgén jelenléte pedig PCR (polimeráz láncreakció) és kvantitatív PCR segítségével könnyen kimutatható, megkönnyítve ezzel a Venus fehérje detektálását és a genotipozálást. GFP transzgénikus egerek esetében már korábban kimutattak glomerulosclerosist (a vese glomerulosainak hegesedése, ami a veseműködés romlásával járhat). Humán klinikai kutatások bizonyították, hogy az elhízás kiválthat glomerulosclerosist, de GFP transzgénikus nyulakon ezeket a kórképeket még nem tesztelték. Előkísérleteinkben Venus fehérje expressziót mutattunk transzgénikus nyulak glomerulosaiban.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Kutatásaim célja, hogy glomerulosclerosist és az elhízást vizsgáljam heterozigóta és homozigóta Venus transzgénikus nyulakban. Az általunk használt új-zélandi fehér nyúl elfogadott állatmodellje a glomeruloscrelosisnak és az elhízásnak, továbbá ez a két kórkép nemcsak humán betegség, hanem problémát jelent a nyúltenyésztésben és házi kedvencként tartott nyulak esetében is, a nőstényeknél és hímeknél egyaránt. Emellett, az elhízott nőstény nyulak kevesebb utódot ellenek és élettartamuk is lerövidül egészséges fajtársaikhoz képest. Jelenleg nyulakban csak magas zsír vagy koleszterin tartalmú diétával lehet glomerulosclerosist kiváltani, ami komoly anyagi és időráfordítást igényel. Kutatásaink választ adhatnak arra, hogy Venus homozigóta és/vagy heterozigóta transzgénikus nyulak jobb modellállatai lehetnek-e a humán glomerulosclerosisnak és az elhízásnak, mint a vad típusú nyulak. Alapkutatási szempontból fontos a Venus expresszió változása a fent említett kórképekben, mert ezt eddig nem vizsgálták GFP transzgénikus állatokban. Ezen kívül kísérleteink által jobban megismerhetjük a nyúltenyésztésben problémát jelentő elhízás hátterét.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! Eredményeink segítségével mélyebb betekintést nyerhetünk az alapkutatásban gyakran használt CAGGS-GFP transzgénikus állatok általános egészségi állapotába. Továbbá, a Venus transzgénikus nyulakkal modellezni kívánt humán focalis segmentalis glomerulosclerosis az egyik vezető oka a veseelégtelenség kialakulásának. A más kutatócsoportok által használt transzgénikus glomerulosclerosis egérmodellek nem mindig nyújtanak a humán betegségre átültethető, extrapolálható eredményeket. A kutatási téma sikeressége esetén egy új nyúl glomerulosclerosis állatmodellt tudnánk jellemezni és publikálni, amely a jövőben talán a gyógyszer-hatóanyag fejlesztésben is használható lehetne.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A zöld fluoreszcens fehérjét expresszáló nyulaink segítségével kívánjuk modellezni az emberi populációban egyre nagyobb százalékban előforduló veseelételenség egyik kiváltó okát, a glomerulosclerosist. A glomerulosclerosis egy olyan betegség, mely a vizelet kiválasztásban alapvető fontosságú glomerulusok (magyarul vesetestecskék) elhalásával és a veseműködés romlásával jár. Emellett, a szintén egyre több embert érintő elhízás és a glomerulosclerosis közötti lehetséges összefüggést is vizsgálnánk a transzgénikus nyúl modellünk segítségével.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The transgenic construct, including the Venus fluorophore protein driven by a ubiquitous CAGGS promoter, was successfully integrated into rabbit genome by Sleeping Beauty transposition and the Venus protein was expressed in all organs (Katter et al., 2013). The Venus protein is detectable using blue light illumination. Both homozygote and heterozygote transgenic lines were successfully established and maintained in the past three years. Venus protein is a yellow shifted derivative of the previously identified and widely used GFP (green fluorescent protein). Recently, the expression of the Venus protein was determined in the transgenic rabbit mature spermatozoa and testis (Hoffmann et al., 2016, under consideration). The fluorescence Venus protein is easily detectable by flow cytometry, fluorescence microscopy and microplate reader. In a previous study, glomerulosclerosis and proteinuria were observed in CAGGS-GFP transgenic mice. Several clinical studies claimed the relationship between obesity and glomerulosclerosis but these diseases were not examined in CAGGS- GFP transgenic rabbits.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The aim of the present research is to examine the glomerulosclerosis and obesity in Venus transgenic rabbits. Obesity and glomerulosclerosis are not only human diseases, but also a problem in rabbit breeding and pet rabbit medicine. Moreover, obese does bear less offsprings and die earlier compared to healthy rabbits. To our knowledge, glomerulosclerosis were only observed in obese rabbits fed a high-fat or high cholesterol diet. We raised the question whether the Venus transgenic heterozygote and/or homozygote are better animal models of human glomerulosclerosis than wild type rabbits or GFP transgenic mice.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. The goal of the present research is to provide more data about general health of transgenic laboratory animals expressing GFP. Additionally, the human focal segmental glomerulosclerosis is the most common primary glomerular disorder causing end-stage renal disease. Transgenic glomerulosclerosis mouse models are not always show all symptoms of human glomerulosclerosis, so better animal models need to be established.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Our green fluorescent protein expressing transgenic rabbits gave us an opportunity to analyze human glomerusclerosis, which is a common glomerulopathy and causes end-stage renal disease. Moreover, the relationship between obesity and glomerulosclerosis has not been examined in GFP transgenic animals yet.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
FSGS-t mutattunk ki Sleeping Beauty módszerrel létrehozott Venus TG nyulakban. Proteinuria-t Venus heterozigóta, mikroszkópikus hematuria-t Venus homozigóta nyulakban detektáltunk. A vizelet vizsgálat eredményeit alátámasztva, sclerotikus glomerulosokat és glomerulomegáliát találtunk PAS szövettani festéssel Venus TG nyulak vesekéreg metszeteiben (Lipták et al., 2018, Acta Vet. Hung.).
Hím vad típusú (WT) és Venus TG nyulakat etettünk normál vagy magas koleszterin-tartalmú (0.5 %) táppal 8 héten keresztül. Szérum koleszterinszint emelkedés koleszterinnel etetett WT és TG nyulaknál is megfigyelhető volt a 4. és 8. héten, míg normál táppal etetett nyulak esetében nem.
Továbbá, Venus fehérjét detektáltunk laktáló Venus TG nőstények tejében és tejmirigyében. Eredményeink alapján a Venus fehérje emlőspecifikus promoter és szekréciós szignál peptid nélkül jutott be a tejbe, ami egy új megközelítés a rekombináns fehérjék tejbe történő termeltetésének (Kerekes et al., 2017, PloS One).
Az idén közölt review cikkünkben összegyűjtöttük a GFP lehetséges kóros hatásait GFP TG állatokban (Lipták et al., 2019, Physiol. Res.).
kutatási eredmények (angolul)
FSGS was detected in Venus TG rabbits generated by Sleeping Beauty (SB) transposition. Urinalysis revealed proteinuria in Venus heterozygote TG bucks, while Venus homozygote TG bucks developed microscopic hematuria. Supporting the urinalysis data, the histological findings of FSGS (glomerulomegaly and sclerotic glomeruli) were observed in PAS-stained renal cortex sections of Venus TG rabbits (Lipták et al., 2018, Acta Vet. Hung.).
Male wild type (WT) and TG rabbits were fed either standard rabbit chow (Purina Uni) or cholesterol- (0.5%, ssniff Spezialdiäten GmbH, Germany) enriched diet for 8 weeks to induce hypercholesterolemia. Pre-prandial serum cholesterol level was elevated in both cholesterol-fed TG and WT rabbits after 4 and 8 weeks, while hypercholesterolemia was not detected in standard chow-fed rabbits.
Additionally, Venus protein was detected in milk samples and mammary gland of lactating Venus TG does. Our results demonstrated the secretion of recombinant protein into milk despite the lack of mammary gland specific promoters and signal peptide cDNA for the secretory pathway. This is a novel approach for the production of recombinant proteins into the milk of TG rabbits (Kerekes et al., 2017, PloS One)
In our recently published review, we have collected the in vivo data of GFP-induced pathology in GFP TG animals (Lipták et al., 2019, Physiol. Res.).
Lipták N, Bősze Z, Hiripi L: GFP Transgenic Animals in Biomedical Research: A Review of Potential Disadvantages., PHYSIOLOGICAL RESEARCH 68: (4) pp. 525-530., 2019
Liptak N, Hoffmann OI, Skoda G, Gocza E, Kerekes A, Bosze Z, Hiripi L: Glomerulosclerosis in transgenic rabbits with ubiquitous Venus protein expression., ACTA VET HUNG 66: (2) pp. 281-293., 2018
Kerekes A, Hoffmann OI, Iski G, Liptak N, Gocza E, Kues WA, Bosze Z, Hiripi L: Secretion of a recombinant protein without a signal peptide by the exocrine glands of transgenic rabbits., PLOS ONE 12: (10) p. e0187214., 2017
Lipták Nándor, Bősze Zsuzsanna, Hiripi László: Sex differences in the severity of glomerulosclerosis in Venus transgenic rabbits, In: PhD Tudományos Napok 2019, (2019) p. 1., 2019
Liptak N, Hoffmann OI, Skoda G, Gocza E, Kerekes A, Bosze Z, Hiripi L: Glomerulosclerosis in transgenic rabbits with ubiquitous Venus protein expression., ACTA VET HUNG 66: (2) pp. 281-293., 2018
Kerekes A, Hoffmann OI, Iski G, Liptak N, Gocza E, Kues WA, Bosze Z, Hiripi L: Secretion of a recombinant protein without a signal peptide by the exocrine glands of transgenic rabbits., PLOS ONE 12: (10) p. e0187214., 2017
LIPTÁK N, Hiripi Lászó, Bősze Zsuzsanna: The analysis of gene expression for antioxidant enzymes in normal and cholesterol-fed Venus transgenic rabbits, , 2018
Nándor Lipták (szerk.): The assessment of Venus transgenic cell migration during pregnancy in non-transgenic rabbits, Eger: 1 p., 2017
