Egyes Medicago truncatula gümő-specifikus cisztein-gazdag (NCR) peptideket kódoló gének esszenciális funkciójának vizsgálata a rhizobium terminális bakteroid differenciációjában.
Angol cím
The functional analysis of the indispensable of Medicago truncatula nodule-specific cysteine-rich (NCR) peptide family required for rhizobium terminal bacteroid differentiation.
Sejtgenetika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
25 %
Ortelius tudományág: Molekuláris genetika
zsűri
Sejt- és Fejlődésbiológia
Kutatóhely
Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet (Nemzeti Agrárkutatási és Innovációs Központ)
projekt kezdete
2016-12-01
projekt vége
2019-11-30
aktuális összeg (MFt)
15.087
FTE (kutatóév egyenérték)
2.10
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A biológiai nitrogénkötés leghatékonyabb formája a pillangós virágú növények és a rhizobium baktériumok között létrejövő endoszimbiotikus kapcsolat. A baktériumok kolonizációja a gazdanövény gyökerén egy új szerv, a gyökér gümű fejlődését indítja el, amelyben a bakteriumok egy növényi eredetű membránnal határolt szimbioszómákban helyezkednek el. A Medicago truncatula–Sinorhizobium szimbiotikus kapcsolat kialakulása során a baktériumok osztódás nélküli többszörös endoreduplikációs folyamat következtében megnyúlt nitrogénkötő bakteroidokká alakulnak át. Ezt az úgynevezett irreverzibilis terminális bakteroid differenciációt a gazdanövény által termelt közel 600 gümő- specifikus cisztein gazdag fehérje irányítja. Kutatócsoportunk egy másik kutatócsoporttal párhuzamosan kimutatta az NCR géncsalád NCR169 és NCR211 tagjáról, hogy hiányuk egyenként a dnf7-2 és dnf4 mutáns vonalban a bakteroid differenciácó meghibásodását és ennek következtében egy nem működő nitrogénkötő kapcsolatot eredményezett. A benyújtott témajavaslatban célul tűztük ki az NCR169 és NCR211 gének szabályozásában szerepet játszó cisz szabályzó elemek meghatározását, melyet a két NCR gén különböző módosított promóter változataival hajtott génkonstrukciók komplementácós képességének tesztelésével végezzük el a mutáns növényeken. Ehhez hasonlóan tervezzük azonosítani azokat az aminosav részeket az érett fehérje részen, amelyeknek a két NCR fehérje működésében meghatározó szerepük van. Ezen kívül tervezzük a bakteroid differenciációhoz nélkülözhetetlen további új NCR gének azonosítását reverz genetikai megközelítésben.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. A terminális bakteroid differenciáció a pillangósvirágú növények IRLC (Inverted Repeat-Lacking Clade) csoportjának tagjaira (pl. Medicago truncatula) jellemző folyamat, amelyet a gümő-specifikus cisztein gazdag fehérjék (NCR) irányítanak. A M. truncatula genom közel 600 NCR fehérjét kódol, amely a fehérjék redundáns szerepét feltételezte. Kutatócsoportunk egy másik csoporttal párhuzamosan mutatta ki, hogy az NCR169 és az NCR211 egyenkénti deléciója a dnf7-2 és dnf4 mutáns növényben a bakteroid differenciáció és a nitrogénkötő szimbiotikus kapcsolat meghibásodását okozta. Ezen eredmények utaltak arra, hogy néhány NCR fehérjének egyedi szerepe van a bakteroid differenciációban. Érdekes kérdésnek bizonyult az, hogy a két NCR fehérje milyen egyedi módon képes szabályozni a bakteroid differenciáció folyamatát és létezik-e más NCR, amely egyedi szerepet tölt be a fehérje funkciójában. Az NCR géncsalád tagjai specifikus expressziós mintázatot mutatnak a gümő fejlődése során, amely összefüggésben van a bakteroid differenciációban betöltött szerepükkel. Feltételezzük olyan cisz reguláló elemek jelenlétét a két NCR promóterében, amelyek hozzájárulnak az NCR fehérjék egyedi funkciójához. Következő kérdésként merült fel, hogy melyik aminosav részek felelősek a fehérje esszenciális funkciójában. Korábbi tanulmányokból ismert, hogy néhány NCR képes kölcsönhatásba lépni más NCR-el, azonban az még nem tisztázott, hogy az NCR-ek egy állandósult vagy folyamatosan változó összetételű komplexet képezve vagy a funkciójuk időben egymást követve szabályozza a differenciáció folyamatát. Úgy gondoljuk, hogy az új egyedi funkciójú NCR fehérjék azonosítása hozzájárul ezen elgondolások eldöntésére.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A nitrogén az egyik legfontosabb tápanyag a növények növekedéséhez és fejlődéséhez, azonban a nagy mennyiségben elérhető formája (légköri N2) a növények számára nem hasznosítható. A nitrogén felvételének leghatékonyabb módja a biológiai nitrogénkötés. A pillangós virágú növények, mint például a Medicago truncatula képes szimbiotikus nitrogénkötő kapcsolat kialakítására a talajlakó rhizobium baktériumokkal, amelynek során a baktériumok a nitrogént a növények számára felvehető ammoniává redukálják. Ez a szimbiotikus kapcsolat egyrészt előnyt jelent a pillangós virágú növények fejlődéséhez kedvezőtlen körülmények között, másrészt nagymértékben gazdagítják a talaj nitrogénforrását. Ennek következtében a pillangós virágú növények termesztése a mezőgazdaságban egy fenntartható technológát nyújt a talaj minőségének javításában a műtrágya használatának visszaszorítása érdekében. M. truncatula esetében a baktériumok egy irreverzibilis terminális bakteroid differenciáció során alakulnak át nitrogénkötő bakteroidoká, amely egy sokkal hatékonyabb nitrogénkötő képességet eredményez. A terminális bakteroid differenciációt M. truncatulában közel 600 tagú gümő-specifikus cisztein gazdag (NCR) fehérje irányítja. Jelen témajavaslatban folytatjuk az NCR169 és NCR211 fehérje egyedi szerepének a vizsgálatát a bakteroid differenciációban. Vizsgáljuk a két NCR gén szabályozásában szerepet játszó cisz-reguláló elemeket és azonosítjuk az érett fehérjében azokat az aminosav részeket, amelyek nélkülözhetetlenek a fehérje funkciójához. Mindezen felül további új nélkülözhetetlen NCR fehérje azonosítását tervezzük a nitrogénkötő kapcsolat kialakításában. A bakteroid differenciáció folyamatának részletesebb megismerése a későbbiekben hozzájárulhat egy hatékonyabbá tehető szimbiotikus nitrogénkötő folyamat kialakításához a mezőgazdaságban. Az NCR fehérjék egyedi funkciójának felismerését párhuzamosan egy amerikai kutatócsoporttal elsőként közöltük, amely pozíciót a téma folytatásában kapott eredmények közlésében szeretnék megőrizni.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. Az élő szervezetek számára egyik nélkülözhetetlen biogén elem a nitrogén, építő kövei az egyes nukleinsavaknak, aminosavaknak és szerves vegyületeknek. Habár a nitrogén nagy mennyiségben a légkörben megtalálható, ebben a formában a legtöbb szervezet számára nem hasznosítható. Számos mikroorganizmus képes a légköri nitrogént az élő szervezetek számára felvehető ammoniává redukálni. A biológiai nitrogénkötés a leghatékonyabb módja a nitrogén felvételének, amelynek példája a pillangósvirágú növények a talajlakó rhizobium baktériumokkal kialakított endoszimbiotikus kapcsolata. A szimbiotikus kapcsolat eredményeként a gazdanövény gyökerén képződik a gyökér gümő, amelyben a nitrogén kötés folyamata zajlik. A pillangósvirágú növények két féle gümőtípus kialakítására képesek, amelyek a gümő sejtek fejlődésében és a baktériumok nitrogénkötő bakteroiddá való átalakulás folyamatában különböznek. A mérsékelt égövi pillangósvirágúakban, mint például a Medicago truncatula-ban a baktériumok a növény által szabályozott irreverzibilis fejlődési folyamaton mennek keresztül, amelynek során a bakteroidok megnyúlt alakot vesznek fel a genom többszörös replikációja révén. A baktériumok ezen fejlődési folyamata egy hatékonyabb szimbiotikus kapcsolatot eredményez. A terminális bakteroid differenciáció közel 600 tagú gümő-specifikus cisztein gazdag (NCR) fehérjék által szabályozott. A benyújtott témajavaslatban tervezzük vizsgálni az NCR gének egyedi szabályozó folyamatát a bakteroid differenciációban és azonosítjuk a fehérje azon elemeit, amelyek meghatározóak a működésükben. A kutatás során kapott új eredmények elősegíthetik a szimbiotikus nitrogénkötés hatékonyabbá tételét a mezőgazdaságban.
angol összefoglaló
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. The most effective form of biological nitrogen fixation is the endosymbiotic interaction between legumes and rhizobia. The colonization of the rhizobia on the roots of the host plant induce the formation of new organ, called root nodule, wherein the bacteria are surrounded by plant-derived membrane forming the symbiosome. In the Medicago truncatula-Sinorhizobium interaction the bacteria differentiate into nitrogen fixing elongated bacteroids following several endoreduplication cycles without cytokinesis. This irreversible terminal bacteroid differentiation process is regulated by the gene family of nodule-specific cysteine rich (NCR) peptides with about 600 members as plant factors. It has been recently demonstrated that the loss of the NCR169 and NCR211 peptides resulted in impaired bacteroid differentiation and consequently abolishes symbiotic nitrogen fixation phenotype in dnf7-2 and dnf4 mutant plants. These two mutant plants provide excellent tools to study the regulation and the unique function of the two NCRs. We proposed to the following three main objectives in recent project: (i) In a genetic complementation assay we plan to identify the essential promoter cis-regulatory elements required for specific NCR expression pattern of two NCRs using various modified promoter versions (ii) Similarly, we will determine residues of the mature peptides that provide the unique function of two NCRs. (iii) In a reverse genetic approach we will attempt to isolate novel essential non redundant NCRs required for bacteroid differentiation using of the M. truncatula Tnt1 insertion and deletion mutant collection.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. The irreversible terminal bacteroid differentiation is restricted to the IRLC (Inverted Repeat-Lacking Clade) legumes (such as Medicago, Pisum etc.) and this differentiation process is regulated by a nodule-specific cysteine rich (NCR) peptides as plant factors. In the M. truncatla genome close to 600 genes encode NCR peptides suggested their function may overlap and they act redundantly. We and another research group have recently demonstrated that the NCR169 and NCR211 genes are unique among the NCR gene family and they are essential for impaired bacteroid differentiation. Interesting question is how these two NCRs can individually regulate the bacteroid differentiation? The members of the large NCR gene family have slightly different expression pattern during symbiotic nodule development correlated with their function in bacteroid differentiation. Consequently, we assumed that the presence of the cis-regulatory elements in the promoter region of the NCR genes may fine-tune their regulation. NCR genes encode highly divergent 30-50 amino acids long mature peptides with 4 or 6 cysteine residues in conserved positions. Another question is which amino acids have are essential for the function of NCRs? It was demonstrated that some NCRs can interact with other NCR peptides but it is still unknown whether the NCR peptides have act in a dynamic or in a stable complex and their activity is required consecutively each other in the differentiation process. In this project we attempt to identify novel unique NCRs which may provide us some information how the NCRs function during the bacteroid differentiation.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. Nitrogen is an essential nutrient for plant growth and development but the most prevalent form of nitrogen (N2) is not accessible for the plants. The symbiotic nitrogen fixation is an effective form of nitrogen assimilation. Leguminous plants such as Medicago truncatula are able to establish symbiotic association with the nitrogen fixing soil bacteria, rhizobium wherein the bacteria reduce the nitrogen gas to ammonia and provide nitrogen source for the plants. These symbiotic capacities confer selective advantages on leguminous plants to grow in habitats of low nutrient and enrich the soil resources with higher amount of nitrogen. The cultivation of leguminous plants in agriculture provides a sustainable technology to reduce the chemical nitrogen fertilization. In M. truncatula the bacteria differentiate terminally into nitrogen fixing bacteroid. This differentiation process results in significantly effective symbiotic association and subsequently the ability of nitrogen fixation is more effective. The terminal bacteroid differentiation is regulated by nodule-specific cysteine rich (NCR) peptides as plant factors. In the proposed project we plan to continue the dissection of the role of the unique function of the NCR169 and NCR211 peptides and we attempt to identify new essential NCRs required for the nitrogen fixation process. In a previous study it was determined that the in vitro treatment of rhizobia with some NCRs are able to induce bacteroid elongation. The detailed recognition of this differentiation process may contributed to improve the effectiveness of symbiotic nitrogen fixation in agriculture. In a cooperation with another Hungarian and an American research group we demonstared that the NCR169 is essential for bacteroid differentiation. Our results and experiences provide an excellent position for our group to continue with the study of the NCR genes and publish our results in highly ranked scientific journals of the field.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. Nitrogen is an essential biogenic element for all organisms because it is a component of the subunits of nucleic acids, proteins and other indispensable organic compounds. Although the nitrogen composed the large proportion of atmosphere, this form is not accessible for the most biological organisms. Several microorganisms are able to convert atmospheric nitrogen into ammonium which form can be utilized by other living organisms. The symbiotic nitrogen fixation is the most effective form of biological nitrogen fixation. Leguminous plants are able to establish endosymbiotic interaction with soil bacteria, rhizobia. The interaction between the two partners results in the formation a new organ, root nodule, wherein the nitrogen fixation takes place. The legumes are able to develop two type of nodules, wherein the development of nodule cells and the differentiation of bacteria into nitrogen fixing bacteroid is different. In the case of temperate legumes such as Medicago truncatula, the bacteria undergo a plant-directed irreversible differentiation, wherein the bacteroids elongate as the consequence of continuous genome replication without cytokinesis. This differentiation process results significantly effective symbiotic relationship that plays a prominent role in the agricultural crop production. The terminal bacteroid differentiation is regulated by the family of nodule-specific cysteine rich (NCR) peptides with close to 600 members. In this proposal, we plan to dissect the specific aspects of the regulation of the NCR genes, define the essential amino acids required for their activity and identify additional NCRs that have unique role in the bacteroid differentiation.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
Az irreverzibilis terminális bakteroid differenciáció folyamatát növényi faktorként a gümőspecifikus cisztein- gazdag NCR fehérjék szabályozzák. A Medicago truncatula genomban mintegy 600 gén kódolja az NCR fehérjéket. Az NCR fehérjékre jellemző nagyfokú aminosav szekvencia eltérések ellenére redundáns szerepüket feltételezték. Korábbi tanulmányok kimutatták, az NCR169 és NCR211 fehérjék nélkülözhetetlenek a szimbiotikus nitrogénkötő kapcsolat kialakulásában és kulcs szerepük van a bakteroid differenciációban M. truncatula-ban, azonban a gének szabályozása és a fehérjék pontos funkciója ismeretlen. Ebben a tanulmányban meghatároztuk azt a minimális promóter régiót, amelyek szükségesek az NCR169 és NCR211 megfelelő gén szabályozásához. A két promóter specifitásának vizsgálatában kimutattuk, hogy az NCR169 gén szabályozásához nélkülözhetetlen cisz elemek az NCR211 promóterében hiányoznak. Bizonyítottuk egy, az NCR169 és NCR211 promóterében lévő konzervált DNS motívum szükségességét a gének szabályozásában. Annak vizsgálatában, hogy a ciszteinek mellett mely fehérje részek szükségesek az NCR169 aktivitásához, kimutattuk további két aminosav esszenciális szerepét az NCR169 fehérje funkciójában. Nitrogénkötésben hibás növényeket használva két új NCR-t azonosítottunk, amelyeknek egyedi szerepük van a bakteroid differenciációban M. truncatulaban. A bakteroidok összehasonlító elemzése kimutatta, hogy a bakteroid a legmagasabb differenciációs fokot a két új ncr mutánsban érik el.
kutatási eredmények (angolul)
The irreversible terminal bacteroid differentiation process is regulated by the nodule-specific cysteine rich (NCR) peptides as plant factors. In the Medicago truncatla genome, close to 600 genes encode NCR peptides. Despite the highly divergent sequence of the NCR their suggested functions were redundant. Previous studies have shown two of them, NCR169 and NCR211 have essential function in symbiotic nitrogen fixation and they are key components of bacteroid differentiaton in M. truncatula, but the regulation of these genes and the functions of the peptides is unknown. In this scientific work we determined the minimal promoter region of NCR169 and NCR211 which sufficient for the proper gene expression. The investigation of the specificity of the two NCR promoter established the NCR211 promoter is lack-of cis regulatory elements which important for the NCR169 gene expression. Above all we proved the requirement one of the conserved motif in NCR169 and NCR211 promoter for the regulation of the two NCR genes. Due to the dissection what residues are necessity beside the cysteine for the activity of NCR169 we determined two amino acids in the NCR169 mature peptide for the function of NCR169. Using nitrogen fixing deficient plants we identified two new NCR peptide required for the differentiation of bacteroids in M. truncatula. The comparative analyses of the bacteroids showed the highest level of the bacteroids differentiation were present in the two new ncr mutants.
Beatrix Horváth, Ágota Domonkos, Ferhan Ayaydin, Yuhui Chen, Rujin Chen, Péter Kaló: Differential analysis of Medicago truncatula mutants deficient in NCR peptides essential for symbiotic nitrogen fixation, 13th European Nitrogen Fixation Conference (ENFC), Stockholm, Sweden August, 18-21, 2018. poszter, 2018
Beatrix Horváth, Berivan Güngör, Mónika Tóth, Ágota Domonkos, Ferhan Ayaydin, Yuhui Chen, Rujin Chen, Péter Kaló: Comparative analysis of Medicago truncatula mutants deficient in NCR peptides essential for symbiotic nitrogen fixation, 21st International Congress on Nitrogen Fixation, Wuhan, China October 10-15, 2019. poszter, 2019
