 |
Sejtkultúrák nagy-áteresztőképességű egyedi sejt manipulációja és pikoliter térfogatú mintavételezése
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
124559 |
| típus |
PD |
| Vezető kutató |
Ungai-Salánki Rita Zsanett |
| magyar cím |
Sejtkultúrák nagy-áteresztőképességű egyedi sejt manipulációja és pikoliter térfogatú mintavételezése |
| Angol cím |
High-throughput single cell manipulation and picoliter scale sampling of cell cultures |
| magyar kulcsszavak |
nagy-áteresztőképesség, egyedi sejt, extacelluláris ATP,sejt-sejt kommunikáció, pikoliter tartomány |
| angol kulcsszavak |
high-throughput, single cell, extracellular ATP,cell-cell communication, picoliter scale |
| megadott besorolás |
| Biofizika (pl. transzport-mechanizmusok, bioenergetika, fluoreszcencia) (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 80 % | | Ortelius tudományág: Biofizika | | Sejtbiológia, molekuláris transzportmechanizmusok (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 20 % |
|
| zsűri |
Sejt- és Fejlődésbiológia |
| Kutatóhely |
Biológiai Fizika Tanszék (Eötvös Loránd Tudományegyetem) |
| projekt kezdete |
2017-12-01 |
| projekt vége |
2022-11-30 |
| aktuális összeg (MFt) |
15.219 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
2.16 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
Az embrió fejlődésének vagy a tumor kialakulásának mélyebb szintű megértéséhez szükséges a genetikai és transzkripciós információ minél részletesebb kinyerése az egyedi sejtekből. A kutatásom egyik célja egy gyors, nagy-áteresztőképességű egyedi sejt izolálási technika kialakítása RNS/DNS szekvenálás céljából. A CellSorter mikropipetta berendezést fogom alkalmazni legalább 100 egyedi sejt mikroszkópos kép alapján történő izolálására standard sok-lyukú plate-be, 15 perces időn belül, mivel a jelenleg elérhető sejtválogató robotok erre nem képesek. A nagy-áteresztőképességű vizsgálatok elvégzése sejtbiológiai „plate”-eket alkalmazva a rákdiagnosztikában és a gyógyszerhatóanyagok tesztelésében is hasznos lesz.
Sejtjeink egymás segítségével kommunikálnak, többek között (víz) oldható molekulákkal. Bár számos technika létezik pl. a neuronok tér és időbeli elektromos kommunikációjának követésére, azonban az oldható molekulák in vivo monitorozása rendkívül nehéz, legtöbb esetben lehetetlen. Célunk, hogy a sejttenyészetből a piezoelektromos mikropipettával vett pL-es térfogatú mintában az oldható anyagok koncentrációját meghatározzuk. A szokásos in vitro sejtkultúrákat makroszkópikus folyadék térfogatban tartják, azonban ez nem megfelelő a folyadék konvekciója miatt. Terveink között szerepel, hogy minimalizáljuk a folyadék konvekcióját a 35 mm-es Petri csészében elhelyezett 1 x1 mm2-es mikrokutakban. Az oldható anyagok koncentrációját in situ a mikroszkópon fogjuk meghatározni lumineszcens reagensek segítségével. A lokális ATP koncentrációk mérésével megvizsgáljuk a sejt-sejt kommunikációt in vitro.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Egy gyors, nagy-áteresztőképességű egyedi sejtválogató berendezés kifejlesztése fontos feladat, mert így egyedülálló módon képesek leszünk a standard multi-well „plate”-ek egyedi sejtekkel való feltöltésére, melyek igen hasznosak lesznek pl. gyógyszerhatóanyagok tesztelése céljából, vagy pl. a rákkutatásban.
Az extracelluláris ATP-t (eATP) sok esetben veszély jelnek tartják. Felszabadulhat a sérült sejtek citoszóljából, exocitótikus vezikulákból vagy granulumokból. Az eATP azonban nemcsak veszély szignál; átmeneti emelkedése fiziológiás jelként is szolgál az ideg-és érrendszerben. Az oldható molekulák monitorozása rendkívül nehéz, legtöbb esetben lehetetlen. A sejt-sejt kommunikációt fogjuk vizsgálni in vitro a lokális eATP koncentrációjának piezoelektromos mikropipettával történő mérésével.
A mL, µL skálájú folyadékok kezelése rutin feladatnak számít a laboratóriumokban, azonban a 0,1 µL alatti folyadékkezelés már kihívást jelent. A kísérletek során alkalmazni kívánt piezoelektromos mikropipetta nemcsak az egyedi sejtek manipulációját, válogatását, hanem általában a biokémiai, molekuláris biológiai reagensek automatikus folyadékkezelését is forradalmasíthatja rendkívüli pontossága miatt. Pontossága a pL-es tartományban lesz, ami az egyedi sejtek, kis térfogatok kezelésekor fontos követelmény. A Petri csészében jelentős folyadékáramlás van, mely számos kísérletnél problémát jelent. Minimalizálni fogjuk a folyadék konvekcióját a 35 mm-es Petri csészében elhelyezett 100 µm mély, 1 x1 mm2-es mikrokutakban. A mikropipetta nyílásánál nagyobb, szorosan pakolt mikro-gyöngyök alkalmazásával még tovább fogjuk csökkenteni a konvekciót a mikrokutakban.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
Jelenleg még nincs olyan számítógépes-látáson alapuló, egyedi sejtek izolálására alkalmas technika, ami az orvosi diagnosztikai laborokban is megállná a helyét. Az ún. FACS készülékek sok diagnosztikai laborban jelen vannak, akár 10 000 sejt/mp szortírozási sebességre is képesek, azonban kis sejtszám vagy egyedi sejtek kezelésére praktikusan alkalmatlanok. Az általunk fejlesztett sejtválogató berendezés élő sejtek mikroszkópos képe alapján tud egyedi sejteket automatizált módon izolálni RNS/DNS szekvenálás vagy más vizsgálatok céljából. Emellett pedig a mikroszkópos kép alapján történő válogatás hatalmas potenciált rejt magában a FACS-okhoz képest a korai rákdiagnosztikában és más területeken is. Fontosnak tartjuk, hogy lehetővé tegyük a nagy-áteresztőképességű vizsgálatok elvégzését sok-lyukú „plate”-eket alkalmazva, ami az orvosi diagnosztikában és a gyógyszerhatóanyagok tesztelésében is hasznos lesz.
Korábbi sejtválogató berendezésünk több alkatrészből áll, az üzemeltetése nagy szakértelmet és gyakorlatot igényel. Elsősorban kutató laborokban található ehhez megfelelő felkészültség, a kórházak diagnosztikai laborjaiban nincs erre lehetőség. A piezoelektromos mikropipetta bevezetésével a berendezés teljesen automatizálhatóvá és kompaktabbá válik, manuális beavatkozásra nem lesz szükség a működés során. A mL, µL skálájú folyadékok kezelése rutin feladatnak számít a laboratóriumokban, azonban a 0,1 µL alatti folyadékkezelés már kihívást jelent. A piezoelektromos mikropipettával minden korábbinál pontosabb, megbízhatóbb manipulációkat hajthatunk végre az egyedi sejtek szintjén. Úgy gondoljuk, hogy a pipettázott térfogat az eddigi mikro-nanoliteres pontosságú műszer(ek)el szemben picoliteres (de akár femtoliteres) tartományú pontosságban is elérhető lesz, ami az egyedi sejtek, vagy kis térfogatok kezelésekor fontos követelmény. Az oldható molekulák in vivo monitorozása rendkívül nehéz, legtöbb esetben lehetetlen, azonban a piezoelektromos mikropipetta segítségével a sejttenyészetből vett pL-es térfogatú mintában meghatározhatjuk az oldható anyagok (pl. extracelluláris ATP) koncentrációját.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az egyedi sejtek az élet alapegységei. Tanulmányozásuk segít a betegségekre való hajlam megértésében, megfelelő kezelés kiválasztásában, lehetővé teszi a hasonló sejtek közötti heterogenitás és a szövetek felépítésének, működésének megértését is. Ahhoz, hogy egy embrió fejlődését vagy a tumor kialakulását mélyebb szinten is megérthessük, szükséges az egyedi sejtekből történő információ kinyerés. Cél, hogy a CellSorter sejtválogató berendezésünket alkalmazni tudjuk legalább 100 egyedi sejt mikroszkópos kép alapján történő gyors izolálására sok-lyukú sejtbiológiai plate-be, nagy-áteresztőképességgel.
Sejtjeink egymás segítségével kommunikálnak, többek között (víz) oldható molekulákkal. Ezek az anyagok a szövetekben diffúzió útján terjednek és vér vagy más testnedvek segítségével szállítódnak el nagyobb távolságokra. Számos technika létezik pl. a neuronok tér és időbeli elektromos kommunikációjának követésére, azonban az oldható molekulák in vivo monitorozása rendkívül nehéz. Az oldható anyagok koncentrációját a mikroszkópon fogjuk meghatározni lumineszcens reagensek segítségével. A sejt-sejt kommunikációt lokális ATP koncentráció mérésével vizsgáljuk. A kísérletek során alkalmazni kívánt piezoelektromos mikropipetta pontossága a pL-es tartományban lesz, ami az egyedi sejtek, kis térfogatok kezelésekor fontos követelmény. A szokásos in vitro sejtkultúrákat makroszkópikus folyadék térfogatban tartják, azonban ez nem megfelelő a folyadék konvekciója miatt. Terveink között szerepel, hogy minimalizáljuk a folyadék konvekcióját 1 x1 mm2-es mikrokutakban.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
A deeper understanding of a developing embryo or tumor requires genetic and transcriptional information on the constituting individual cells. First goal of my research is to achieve high speed, high-throughput single cell isolation into standard multi-well plates using computer vision for RNA/DNA sequencing. We will apply the CellSorter micropipette to isolate 100 single cells based on their microscopic image into a standard multi-well plate within 15 min for single cell sequencing, because the currently available single cell sorting robots cannot do this. It is important to enable high-throughput studies to use multi-well plates which will be useful in the medical diagnostics of cancer and testing of novel drugs, as well.
Our cells communicate with each other using, among others (water) soluble molecules. Although a number of highly developed techniques exist to follow the electric communication of e.g. neurons in space and time, monitoring soluble molecules in vivo is extremely difficult, in most cases practically impossible. Our aims to determine the concentration of soluble components, after pulling the pL scale sample from the cell culture with the piezoelectric micropipette. Usual in vitro cell cultures kept in macroscopic fluid volumes, however, are not appropriate for this due to the convection of fluid. In this project we aim to minimize convection in the medium by applying even smaller, 1x1 mm2 microwells inside the Petri dish. Concentration of soluble components will be determined in situ with luminescent reagents on the microscope. By measuring local ATP concentration we will investigate the cell-to-cell communication in vitro.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Development of a high speed, high-throughput single cell sorting equipment is an important task, because uniquely we will able to fill standard multi-well plates with single cells which will be very useful in e.g. testing of novel drugs or e.g. in cancer research.
Extracellular ATP (eATP) is considered to be a danger signal in many cases. It can be released from the cytosol or damaged cells or exocytotic vesicles or granules. e-ATP is not only a danger signal. Transient increase of eATP is a physiologic signal in the nervous and vascular systems. Monitoring of soluble molecules is extremely difficult, in most cases practically impossible. By measuring local eATP concentration using the piezoelectric micropipette we will investigate the cell-to-cell communication in vitro.
Liquid handling on the mL or µL scale is a routine task in the laboratories however, handling volumes under 0.1 µL is challenging. The piezoelectric micropipette, it can revolutionize the manipulation and sorting of individual cells, and the automated liquid handling of biochemistry, molecular biology reagents due to its extraordinary accuracy. The accuracy will be in the pL scale which an important requirement in handling of individual cells, small volumes. It is considerable fluid flow inside the Petri dish which is a problem in many experiments. We will minimize the convection in the medium by applying even smaller, 1x1 mm2 microwells inside the 35 mm Petri dish. We will apply closely packed microbeads larger than the micropipette aperture to further decrease fluid convection
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
isolation of single cells. FACS machines are present in many diagnostic laboratories, and they are able to achieve up to 10,000 cells/sec sorting speed, however, for the examination of a small number of sensitive cells or single cells they are inadequate. Our cell sorting technique can isolate single cells automatically, based on the microscopic image of live cells for RNA / DNA sequencing or other studies. Imaging-based cell sorting is a large potential in early cancer diagnostics, and other areas relative to the FACS. We consider it is important to enable high-throughput studies to use multi-well plates which will be useful in the medical diagnostics and testing of drugs, as well.
Our previous cell sorter equipment consists of multiple parts; its operation requires a great competence and experience. It can be found suitable preparedness primarily in research labs; diagnostic labs of hospitals do not have this option. Introducing piezoelectric micropipette, the system comes to completely automates and more compact and manual intervention will not be needed during the operation. Liquid handling on the mL or µL scale is a routine task in the laboratories however, handling volumes under 0.1 µL is challenging. We can perform more accurate, more reliable manipulations than ever before at the level of individual cells. We believe that, the pipetted volume will be available in the picoliteres (even femtoliteres) accuracy range over the micro-nanoliteres precision instruments. Monitoring of soluble molecules in vivo is extremely difficult, in most cases practically impossible; however, it can be determined concentration of soluble molecules e.g. extracellular ATP, pulling the pL scale sample from the cell culture with the piezoelectric micropipette.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Single cells are the basic units of life. Studying them helps to understand predisposition to diseases, to choose the appropriate therapy, allows understanding heterogeneity between cells and structure and operations of tissues. A deeper understanding of a developing embryo or tumor requires information on the constituting individual cells. Our goal is to apply the CellSorter system to isolate at least one hundred individual cells based on their microscopic image into a standard multi-well plate with high-throughput.
Our cells communicate with each other using, among others (water) soluble molecules. These materials spread by diffusion in the tissues, and transported by blood or other body fluids to longer distances. Although a number of highly developed techniques exist to follow for example the electric communication of neurons in space and time, monitoring soluble molecules in vivo is extremely difficult. Concentration of soluble components will be determined with luminescent reagents on the microscope. By measuring local ATP concentration we will investigate the cell-to-cell communication. Accuracy of the piezoelectric micropipette (will be used in our experiments) will be in the pL scale which is an important requirement in the course of handling of individual cells, small volumes. Usual in vitro cell cultures kept in macroscopic fluid volumes, however, are not appropriate for this due to the convection of fluid. In this project we aim to further minimize convection in the medium by applying 1x1 mm2 microwells.
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
Közleményjegyzék |
|
|
| Ungai-Salánki Rita, Csippa Benjamin, Gerecsei Tamás, Péter Beatrix, Horvath Robert, Szabó Bálint: Nanonewton scale adhesion force measurements on biotinylated microbeads with a robotic micropipette., JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE 602: pp. 291-299., 2021 | | Ungai-Salánki Rita, Haty Eleonóra, Gerecsei Tamás, Francz Barbara, Béres Bálint, Sztilkovics Milán, Székács Inna, Szabó Bálint, Horvath Robert: Single-cell adhesion strength and contact density drops in the M phase of cancer cells, SCIENTIFIC REPORTS 11: (1) 18500, 2021 | | Gerecsei Tamás, Ungai-Salánki Rita, Saftics András, Derényi Imre, Horvath Robert, Szabó Bálint: Characterization of the Dissolution of Water Microdroplets in Oil, COLLOIDS AND INTERFACES 6: (1) 14, 2022 | | Gerecsei Tamás, Péter Beatrix, Ungai-Salánki Rita, Kurunczi Sándor, Székács Inna, Szabó Bálint, Horvath Robert: Prospects of fluidic force microscopy and related biosensors for medical applications, In: Nanobioanalytical Approaches to Medical Diagnostics, Elsevier (2022) pp. 1-28., 2022 | | Rita Ungai-Salánki, Benjamin Csippa, Tamás Gerecsei, Robert Horvath & Bálint Szabó: Nanonewton scale force measurements on biotinylated microbeads with a robotic micropipette, To be Submitt. to J. Colloid Interface Sci. in 2021., 2021 | | Rita Ungai- Salánki * , Eleonóra Haty * , Tamás Gerecsei , Barbara Francz , Milán Sztilkovics , Inna Székács, Bálint Szabó, Robert H.: Cell adhesion strength drops in the M phase of cancer cells revealed by computer-controlled micropipette and single-cell optical biosensor, To be Submitt. to J. colloid interface Sci. in 2020., 2021 | | Tamás Gerecsei, Beatrix Péter, Rita Ungai-Salánki, Sándor Kurunczi, Inna Székács, Bálint Szabó, Robert H.: Prospects of Fluidic Force Microscopy and related biosensors for medical applications, Will be appeared in Elsevier, 2021 May, 2021 | | Tamás Gerecsei, Rita Ungai Salanki, András Saftics, Imre Derényi, Robert Horvath & Bálint Szabo: Characterization of the dissolution of water microdroplets in oil, To be Submitted in 2021, 2021 | | Tamás Gerecsei, Beatrix Péter, Rita Ungai-Salánki, Sándor Kurunczi, Inna Székács, Bálint Szabó, Robert Horvath: Prospects of fluidic force microscopy and related biosensors for medical applications, Nanobioanalytical Approaches to Medical Diagnostics, 2022 | | Gerecsei Tamás, Ungai-Salánki Rita, Saftics András, Derényi Imre, Horvath Robert, Szabó Bálint: Characterization of the Dissolution of Water Microdroplets in Oil, COLLOIDS AND INTERFACES 6: (1) 14, 2022 | | Ungai-Salánki Rita, Csippa Benjamin, Gerecsei Tamás, Péter Beatrix, Horvath Robert, Szabó Bálint: Nanonewton scale adhesion force measurements on biotinylated microbeads with a robotic micropipette., JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE 602: pp. 291-299., 2021 | | Ungai-Salánki Rita, Haty Eleonóra, Gerecsei Tamás, Francz Barbara, Béres Bálint, Sztilkovics Milán, Székács Inna, Szabó Bálint, Horvath Robert: Single-cell adhesion strength and contact density drops in the M phase of cancer cells, SCIENTIFIC REPORTS 11: (1) 18500, 2021 | | Barbara Francz, Rita Ungai-Salánki, Éva Sautner, Robert Horvath, Bálint Szabó: Subnanoliter precision piezo pipette for single-cell isolation and droplet printing, Microfluidics and Nanofluidics, 2020 | | Ungai-Salánki Rita, Francz Barbara, Sautner Éva, Horváth Róbert, Szabó Bálint: Egyedi sejtek manipulációja piezoelektromos mikropipettával, MBFT XXVII. Kongresszusa, 2019 | | Ungai-Salánki Rita, Peter Beatrix, Gerecsei Tamás, Orgovan Norbert, Horvath Robert, Szabó Bálint: A practical review on the measurement tools for cellular adhesion force, ADVANCES IN COLLOID AND INTERFACE SCIENCE 269: pp. 309-333., 2019 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
