 |
Hatékony és specifikus genommódosítás Cpf1(Cas12a) nukleáz változatokkal: az endogén, tagelt prion fehérjecsaládba tartozó fehérje lokalizációjának vizsgálata
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
125331 |
| típus |
PD |
| Vezető kutató |
Tóth Eszter |
| magyar cím |
Hatékony és specifikus genommódosítás Cpf1(Cas12a) nukleáz változatokkal: az endogén, tagelt prion fehérjecsaládba tartozó fehérje lokalizációjának vizsgálata |
| Angol cím |
Efficient and specific gene editing with Cpf1 (Cas12a) nuclease variants: intracellular localization of tagged prion protein family members |
| magyar kulcsszavak |
designer nukleázok, CRISPR/Cas rendszer, Cpf1 nukleáz, FokI restrikciós endonukleáz, génmódosítás, homológ rekombináció |
| angol kulcsszavak |
designer nuclease, CRISPR/Cas system, Cpf1 nuclease, FokI restriction endonuclease, genom engineering, homology directed repair |
| megadott besorolás |
| Molekuláris Biológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 100 % | | Ortelius tudományág: Molekuláris biológia |
|
| zsűri |
Genetika, Genomika, Bioinformatika és Rendszerbiológia |
| Kutatóhely |
Molekuláris Élettudományi Intézet (HUN-REN Természettudományi Kutatóközpont) |
| projekt kezdete |
2017-09-01 |
| projekt vége |
2020-08-31 |
| aktuális összeg (MFt) |
15.216 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
2.10 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A CRISPR (clustered regularly-interspaced short palindromic repeats) rendszer felfedezése és génmódosításra való innovatív kifejlesztése az elmúlt pár évben robbanásszerű fejlődést hozott a molekuláris biológia és kapcsolódó tudományterületeken. Felfedezésük óta a CRISPR-rendszereket, mint génmódosító és moduláló eszközöket hatalmas ütemben fejlesztik, újabb megoldásokkal egyre kintebb tolják a teljesítő képességük határait, azonban nem tökéletes specificitásuk egy nyilvánvalóvá vált, komoly korlátot jelent. Nem csak arról van szó, hogy a hasítani kívánt szekvenciák többször is előfordulhatnak a genomban, hiszen ennek elkerülését már predikciós szoftverek segítik, hanem, hogy ezek a nuklázok szekvencia specificitása nem tökéletesen megbízható, így esetenként több, akár 5 nukleotidban is eltérő szekvenciákat is képesek hasítani. Ez számos alkalmazásban jelenthet problémát. Célunk ebben a kutatási programban olyan CRISPR-alapú rendszerek fejlesztése, melyek az eddigieknél még specifikusabbak, illetve szélesebb szekvencia tartományban is hatékonyan működnek. Céljaink: 1. Szélesítjük a legmegbízhatóbban működő dCas9-FokI nukleázok által módosítható DNS targetek számát; 2. Csökkentjük a Cpf1 nukleázok feltételezhető off-target eseményeit dCpf1-FokI fúziós fehérjék alkalmazásával; 3. Az 1-es és 2-es pontokban kifejlesztett eljárásokkal az endogén prion fehérjecsaládba tartozó fehérjék fluoreszcens taggel való ellátását szeretnénk megvalósítani.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
A dSpCas9-FokI fúziós fehérje a legmegbízhatóbban működő, tehát a legkisebb off-target hatással rendelkező Cas9 variáns, azonban használatát erősen korlátozza, hogy a működéséhez szükséges két DNS targetnek meghatározott, 13-17 nukleotid távolságban kell lennie. Olyan új FokI fúziós nukleáz variánsok létrehozását tervezzük, amelyekkel nagymértékben megnövelhetjük az elérhető szekvenciák számát. FokI fúziós variánsok között tervezünk RNS aptameren alapuló, illetve más eltérő PAM szekvenciákkal működő inaktív Cpf1 nukleázos rendszerek létrehozását is. Ezeknek a kombinálásával feltételezhetően többféle és különböző távolságokban levő targetek esetében lesz képes a FokI domén dimerizálódni, majd a DNS targetet specifikusan hasítani. Így eredményeink lazítani fogják a FokI fúziós rendszerek szigorú megkötését, vagyis a két adott távolságban lévő NGG PAM-ot tartalmazó target szekvencia jelenlétére; kiterjesztik a Cas9-FokI fúziós rendszer hatékonyságát és használhatóságát anélkül, hogy fel kéne adni a rendszer biztosította nagyobb specificitásból és legkisebb off-target hatásából származó előnyöket. Végül az így kifejlesztett módszerrel GFP tagelt prion, shadoo és doppel fehérjéket expresszáló emlős sejtvonalak létrehozását valósítjuk meg.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A kutatási programban új módszereket fejlesztünk, amelyek tovább tökéletesítik a létező genom módosító CRISPR-alapú rendszereket. Reményeink szerint az általunk kidolgozott módszer számos kutatócsoport problémáját oldja majd meg a jövőben. Ezeknek az eszközöknek és továbbfejlesztéseiknek a társadalmi hasznosíthatósága szinte felmérhetetlen. Csak kiragadott területeket említve, a teljesség igénye nélkül: betegségek vizsgálata korábban elérhetetlen állatmodelleken, gyógyszertesztelésre alkalmasabb, humanizált állatmodellek készítése, génterápiás alkalmazások, például az immunrendszer átprogramozása a szervezet rákos sejtjeinek elpusztítására, az élelmiszeripar és a gyógyszergyártás különböző területei.
Az RNS vezérelt nukleázok ma már a legtöbb kutatócsoport arzenáljában megtalálhatóak, és mivel ez egy kimagaslóan kompetitív szakterület, ahhoz, hogy lépést tudjunk tartani a fejlődéssel szorosan követnünk kell a legfrissebb fejleményeket. Szerencsére a CRISPR-rendszer elemei magas fokú modularitással bírnak, így szerteágazóan variálhatóak/fejleszthetőek, számtalan ötlet megvalósítható, ami valamennyire csökkenti a párhuzamos kutatások megvalósulását. Kifejezetten nyitottak vagyunk a legújabb fejlemények befogadására, amikre alapozva folyamatosan alakítjuk a munkamenetet. Törekszünk az egy időben más területeken való fejlesztések nyújtotta lehetőségeket is kihasználni.
Közel két éve dolgozom Cas nukleázokkal, ez alatt az idő alatt számos CRISPR-Cas assay-hez szükséges tesztrendszert alkalmaztam, módosítottam és hoztam létre. Emellett a Cpf1 nukleázokkal kapcsolatos eredményeimből 2016-ban a Biology Direct folyóiratban jelent meg egy publikáció. A tesztrendszerek ismerete, a publikált, a publikálás alatt álló eredményeimből és az egyelőre nem publikált előkísérleteimből származó tapasztalatom és tudásom elegendő biztonságot ad még egy ílyen kompetitív területen is kitűzött céljaim megvalósítására.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A CRISPR bakteriális immunrendszer felfedezése és génmódosításra való kifejlesztése következtében a molekuláris biológia és minden kapcsolódó tudományterület robbanásszerű technológiai fejlődésen ment keresztül az utóbbi pár évben. A rendszer erőssége abban rejlik, hogy lehetőséget ad a DNS kódban lévő gének precíz, irányított helyeken történő módosítására (javítás, kiejtés, beillesztés) így számos alkalmazási területen felhasználhatóvá válik. Másik nagy előnye, hogy néhány kulcsfontosságú, de moduláris elemből áll, melyek módosításával könnyen tervezhetővé és irányíthatóvá válik a rendszer. Jelenleg a CRISPR rendszer fejlesztése egy kompetitív terület, mely látványosan gyorsan fejlődik, célozva a tökéletesebbre törekvést és a minél szélesebb alkalmazhatóságot. A CRISPR-alapú módszerek egyik korlátját a hibás események létrejötte jelenti. Célunk a jelen munkatervben az, hogy fejlesszünk a CRISPR-alapú eszközök hatékonyságát és szélesebb alkalmazhatóságát úgy, hogy közben mérsékeljük, sőt lehetőleg teljesen megelőzzük a nem kívánatos módosításokat. Azok az eszközök és módszerek melyeket itt tervezünk kifejleszteni, több különböző célra és különböző területeken alkalmazhatóak lesznek, néhányat említve a teljesség igénye nélkül: génterápiás alkalmazásokra, mint például az immunrendszer átprogramozása a szervezett rákos sejtjeinek elpusztítására, betegségek vizsgálatára korábban elérhetetlen állatmodelleken, gyógyszertesztelésre alkalmasabb, humanizált állatmodellek készítésére, illetve alkalmazhatóak lesznek akár az élelmiszeripar és a gyógyszergyártás területein is. Így társadalmi hasznosíthatóságuk szinte felmérhetetlen.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The discovery and the innovative implementation of the bacterial immune system CRISPR (clustered regularly-interspaced short palindromic repeats) as a tool for genome editing during the past few years has triggered an explosion of developments in molecular biology and related fields. At present, developing the palette and versatility of the CRISPR-based genome modification tools is a competitive field with spectacularly intense developments aiming to expand the areas of their applicability by either perfecting or searching for yet new solutions. One of the major limitations of the CRISPR-based method is the appearance of off-target hits. This is not only due to the chance for multiple occurrence of the target sequence of choice in the genome, which may be avoided by using prediction-software, but it is also attributable to its non-perfect fidelity, the mismatch tolerance of the nuclease for up to even 5 mismatches in the complementary target sequence, that may pose serious disadvantage in some of the applications. Our aim is to increase further the productivity and broaden the applicability of CRISPR-based tools by: 1. Broadening the space of target editing possibilities of dCas9-FokI nucleases; 2. Decreasing the off-target events of Cpf1 nucleases by implementing dCpf1-FokI fusion proteins. With these reliable new techniques 3. we aim to create cell lines expressing GFP tagged variants of endogenous prion protein family members.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The dSpCas9-FokI fused protein is the yet known most reliable variant of SpCas9, which means that it has the lowest rate of off-target generation; however, its use is heavily restricted by the necessity to find the appropriate target pairs at 13-17 nucleotides apart. We propose here approaches to generate new FokI fusion variants that can employ different target pairs, thereby broaden the available sequence space for highly specific genome editing. Beside developing RNA aptamer-based systems and employing other CRISPR associated nucleases, which works with different PAM sequences (Cpf1 nucleases) we expect further broadening the target space by combining these approaches using hybrid fusion nucleases. Overall, we would like to improve the efficiency and broaden the applicability of dCas9-FokI genome editing system without compromising its higher specificity and fidelity. With this new approach we plan to GFP tag the endogenous prion, shadoo and doppel proteins in different mammalian cell lines.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The new methods we develop here further perfect the existing CRISPR-based genome editing tools. We hope to expand a new approach that may solve many future genome editing problems. The use of these tools and their improvements can have uncountable benefits for the society. Far from covering all, examples for areas of applicability are: studying diseases on animal models nonexistent before, creation of humanized animal models, gene therapy applications, such as the reprograming of the immune system to kill cancerous cells, food industry and drug production.
RNA guided nucleases represent a highly competitive research area that we closely follow, as might be evident from this proposal, and keep up with the fast developments. Since the elements of CRISPR-system are highly modular, and they can be altered in vast varieties of ways to suite different applications, many innovative ideas can be and are worth to be realized, which might decrease the probability of parallel research efforts being effectuated. We are specifically open to incorporate the newest developments of the field to redirect our curse of action. At the same time, we also stride to utilize new possibilities provided by developments in other research fields.
My research profile focuses on Cas nucleases for nearley two years, during this time I managed to set up, modify and develop different test systems for CRISPR-Cas associated experiments. I’ve managed to publish my Cpf1 related data in Biology Direct in 2016. Based on my experiences of the utilization of different CRISPR-Cas assays, and on my published and my preliminary data, I’m confident that, although the field is very competitive, I will be able to complete the proposed research plan.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
The discovery and the innovative implementation of the bacterial immune system called CRISPR as a tool for genome editing during the past few years has triggered an explosion of developments in molecular biology and related fields bringing the impossible within reach in many areas of research. The great potential of the system is that it allows for precise, targeted modification (such as correction, removal, addition) of almost any gene in the genome which opens up a wide area of applications. Being a modular system with few key but alterable elements it also provides possibility for its own retailoring and perfecting to suite versatile needs. At present developing the palette and versatility of the CRISPR-based genome modification tools is a competitive field with spectacularly intense developments aiming to expand the areas of applicability by perfecting them or searching for new solutions. One of the major limitations of the CRISPR-based method is the appearance of off-target hits. Our aim in this proposal is to increase further the productivity and broaden the applicability of CRISPR-based tools while minimizing its off-target effects. The tools and methods to be developed here may be utilized in various research applications, as such may have many and yet unforeseeable benefits for the society in many areas like: gene therapy applications, such as the reprograming of the immune system to kill cancerous cells, the study of diseases by using model systems not available by now, development of humanized animal model systems for testing drugs, food industry applications, just to name a few.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
