 |
Az SpCas9 nukleáz szekvencia specificitásának meghatározása és működési mechanizmusának megértése
|
súgó 
nyomtatás 
|
Ezen az oldalon az NKFI Elektronikus Pályázatkezelő Rendszerében nyilvánosságra hozott projektjeit tekintheti meg.
vissza »
|
| |
Projekt adatai |
|
|
| azonosító |
128188 |
| típus |
K |
| Vezető kutató |
Welker Ervin |
| magyar cím |
Az SpCas9 nukleáz szekvencia specificitásának meghatározása és működési mechanizmusának megértése |
| Angol cím |
Uncovering the sequence specificity determinants and improving the fidelity of CRISPR-nuclease systems to facilitate their high-end applications |
| magyar kulcsszavak |
CRISPR, Cas9 |
| angol kulcsszavak |
CRISPR,Cas9 |
| megadott besorolás |
| Molekuláris Biológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma) | 100 % | | Ortelius tudományág: Molekuláris biológia |
|
| zsűri |
Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia |
| Kutatóhely |
Molekuláris Élettudományi Intézet (HUN-REN Természettudományi Kutatóközpont) |
| résztvevők |
Ayaydin Ferhan
Bartos Zsuzsa
Czene Bernadett
Fodor Elfrieda
Huszár Krisztina
Karl Vivien Réka
Krausz Sarah Laura
Kulcsár Péter István
Ligeti Zoltán Mihály
Molnár Csaba
Nyeste Antal
Orbán Tamás
Sangeetham Sudheer Babu
Szabó Edit Zsuzsanna
Tálas András
Tóth Eszter
|
| projekt kezdete |
2018-10-01 |
| projekt vége |
2022-09-30 |
| aktuális összeg (MFt) |
48.000 |
| FTE (kutatóév egyenérték) |
24.95 |
| állapot |
lezárult projekt |
magyar összefoglaló A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A CRISPR rendszer felfedezése és genomszerkesztésre való innovatív kifejlesztése az elmúlt 4-5 évben robbanásszerű fejlődést eredményezett a molekuláris biológia és kapcsolódó tudományterületeken, a PCR technika felfedezéséhez hasonlóan, forradalmasítva számos kutatási területet. Bár felfedezésük óta a CRISPR-rendszereket mint genom módosító és moduláló eszközöket hatalmas ütemben fejlesztik, egyre kijjebb tolva a teljesítő képességük határait, még nem eléggé ismert szekvencia specificitásuk, valamint, egyre nyilvánvalóbb a nem tökéletes specifikusságuk is, amely komoly korlátot jelent számos alkalmazásban. Nem csak arról van szó, hogy a nukleázok nem minden targetüket vágják azonos hatékonysággal, hanem, hogy a nukleázok a célzottól több, akár 5 nukleotidban is eltérő szekvenciákat is képesek esetenként hasítani. Ez számos alkalmazásban jelenthet problémát. Célunk ebben a kutatási programban, a CRISPR-Cas nukleázok működési mechanizmusának, szekvencia specificitásának és specifikusságának a jobb megértése. Kitűzött céljaink, miszerint
1. Azonosítjuk azokat a faktorokat, amelyek meghatározzák a a Cas9 nukleázok specifikusságát és olyan variánsokat hozunk létre, amelyek adott target körökben a lehető legnagyobb specifikusságúak;
2. Feltárjuk számos Cas9 nukleáz szekvencia specificitás-jellemzőit és az eddigieknél pontosabb target predikciót dolgozunk ki számukra;
3. Hatékony multiplex genom-módosításra alkalmas rendszereket és módszert dolgozunk ki, és hatékonyságukat demonstráljuk KO sejtek létrehozásával;
nagymértékben jelenthetnek előrehaladást több kutatási területen.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Az SpCas9 nukleáz nem tökéletesen specifikus target felismerése a targethez hasonló "off-target" szekvenciák hasítását is eredményezi, amelynek elkerülésére a target DNS szálait gyengébben kötő mutáns SpCas9 variánsokat készítettek. Kutatócsoportunk kimutatta, hogy ezek a variánsok az általunk készített variánsokkal együtt egy specifikussági sor mentén helyezhetőek el, valamint azt, hogy a targetek egyedi természetüktől függően hasíthatóak vagy off-targettekkel vagy off-target mentesen, vagy nem-hasíthatóak hatékonyan egy adott nukleáz variánssal. Sajnos nem tudjuk prediktálni, hogy melyik target milyen fokozatú, és melyik nukleáz variánssal lenne hasítható off-target mentesen. Célunk, azonosítani azokat a faktorokat amelyek meghatározzák, hogy milyen specifikusággal képes egy adott SpCas9 variáns hasítani egy targetet, ami tudományosan izgalmas és gyakorlati szempontból igen fontos kérdés (1. Feladat). További izgalmas problémát vet fel, hogy a Cas9 nukleázok (Sp, Sa, St, Nm) elviekben 10^12 nagyságrendben képesek különböző szekvenciákat hasítani, a gyakorlatban azonban ennél jelentősen válogatósabbak, sok szekvenciát egyáltalán nem, vagy csak csökkent mértékben hasítanak. Ennek a szelektivitásnak a megértése a 2. Feladat céljai közé tartozik. Bár az SpCas9 hatékonysága bizonyos targetek esetében lehetővé tenne többszörös, egyidejű genom módosításokat , mely szükséges például komplex celluláris útvonalak megismeréséhez, betegség modellek készítéséhez és KO poliploid sejtvonalak létrehozásához, a nagyon kis számban létrejövő sikeresen módosított sejtek kiválogatása a többi sejt közül nagyon nehéz és munkaigényes feladat. Ennek megoldását célozzuk a 3. Feladatban.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A kutatási tervben a CRISPR-Cas9 nukleázok on- és off-target hasítását meghatározó tényezőket célozzuk felderíteni és ezek alapján új módszereket fejleszteni, melyek egy precízebb genomszerkesztés megvalósítását teszik lehetővé. A nukleázok off-target hasítása mögött rejlő szerkezeti meghatározók megértése off-target mentesebb genom módosító stratégia kidolgozását fogja elősegíteni. Különösen jelentősnek gondoljuk az önvágó gRNS-eken alapuló módszerünket, amely milliós nagyságrendű szekvencia vizsgálatával, reményeink szerint a Cas9 nukleázok szekvencia specificitásának jelentősen teljesebb megismeréséhez vezet. Ez a ritkábban vágó, de kisebb off-target hatással működő, eddig kevéssé jellemzett (és szekvencia specificitásuk ismeretének hiányában kevésbé használható) Cas9 nukleázokat is alkalmassá teheti nagy pontosságú célzott genommódosításokra. Számos CRISPR-alapú módszert tervezünk kifejleszteni, azokra a kihívásokra válaszul, melyek nemcsak kutatómunkánk során merülnek fel hanem melyeknek szélesebb körű hasznossága evidens. A többszörösen gén-módosított sejtek azonosítására javasolt módszerünk olyan feladatokat tesz ésszerű munkabefektetéssel megvalósíthatóvá, amelyek eddig nem voltak elérhetőek, bár számos biológiai probléma megoldása megkövetelné. Ilyen például a többszörös-génkiütött KO sejtek létrehozása, melyet itt a többszörös prion-gének kiütésére alkalmazunk emlős sejtekben. A tervezett kutatás során feltárt ismeretek és kidolgozott módszerek társadalmi hasznosíthatósága szinte felmérhetetlen. Néhány kiragadott területet említve: elősegíthetik komplex betegségek vizsgálatát korábban elérhetetlen állatmodelleken, gyógyszertesztelésre alkalmasabb, humanizált állatmodellek készítését, génterápiás alkalmazásokat mint például az immunrendszer átprogramozását a szervezet rákos sejtjeinek elpusztítására, az élelmiszeripar és a gyógyszergyártás területei. A kutatási terv megvalósításához a célzottan széleskörű előkísérleteink eredményei lényeges versenyelőnyt biztosítanak számunkra a nemzetközi szakterületen.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
Az RNS-vezérelt CRISPR-nukleázok felfedezése és precíziós génmódosításokra való alkalmassága számos területen forradalmasította a vizsgálati lehetőségeket, ezért ma már a legtöbb kutató csoport arzenáljában jelen vannak a biológia és rokon területeken. Kimagaslóan kompetitív szakterület, ahol robbanásszerű fejlődések és fejlesztések folynak. A CRISPR-rendszer elemei magas fokú modularitással bírnak, így szerteágazóan variálhatóak/fejleszthetőek, számtalan ötlet megvalósítható, ami valamennyire csökkenti a párhuzamos kutatások megvalósulását. Ígéretességük és intenzív fejlesztésük mellett, azonban, jelenleg még számos korláttal bírnak, mint a nem tökéletes specificitás ami a célzott gén szekvencia mellett a hasonló szekvenciák hasítását is eredményezi. Ez az egyik oka annak, hogy a klinikai alkalmazásuk jelenleg még korlátozott. Célunk, feltárni a Cas9-típusú nukleázok specificitását és háttér-aktivitását meghatározó tényezőket, és olyan rendszereket és módszereket létrehozni amelyek a háttér-hatásokat minimalizálni képesek. Kutatási programunk számos innovatív ötletre épül. Kifejezetten nyitottak vagyunk a legújabb fejleményekre amelyeket más területeken elért fejlesztések adta lehetőségekkel kombinálunk, mint nagy áteresztőképességű mikroszkópia és automatizált sejt-elemzés, és egyedi ötleteinkkel társítva tervezünk kihasználni. A megszerzett tudást és fejlesztett módszereket a pályázati munkánk befejeztével a prion fehérjecsalád funkcióinak vizsgálatára fogjuk alkalmazni melyek segíthetnek a hozzájuk kapcsolódó konformációs betegségek jobb megértésében. Eredményeink nagy mértékben hasznosak lesznek számos más területen is, hazai és nemzetközi vonalon.
| angol összefoglaló Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
The discovery and the innovative implementation of the CRISPR bacterial immune system as a tool for genome editing during the past 4-5 years has triggered an explosion of developments in molecular biology and related fields that, similarly to the discovery of PCR, has brought about a revolution in many research areas. At present, developing the palette and versatility of the CRISPR-based genome modification tools is a competitive field with spectacularly intense developments expanding areas of applicability, however, their sequence specificities are not yet well understood, and their now recognized imperfect target specificity presents a barrier to many applications. This latter consists not only in the nuclease cleaving its targets by different efficiency, but also in that it can cleave mismatched, as far as by 5 nucleotides, targets as well, which may pose serious problems in some of the applications. Our major aim in this project is to understand the sequence specificity and fidelity of the CRISPR-Cas nucleases. By aiming to
1. Identify those factors that determine the sequence specificity of SpCas9 nucleases and create mutant variants that have the highest specificity for given sets of targets;
2. Decipher the sequence specificities of various Cas9 nucleases and develop a more accurate prediction tool for their specificity;
3. Develop systems and a method for efficient multiplex gene editing and validate their performance by generation of prion family gene-KO cells;
will lead to results that provide advances for many research areas.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
The non-perfect target specificity of the SpCas9 nuclease results also cleavage at “off-target” sites that are segments having similar sequences with the target. To avoid this, mutant SpCas9 variants had been generated that weaken the interactions with the DNA strands at the target site. Our results demonstrate that these and the similar variants developed by us can be ranked in order of specificity, and also that the targets bear an inherent ranking among themselves, in respect of allowing or not for off-target hits while being cleaved, or alternatively not allowing cleavage at all, by a given nuclease. Unfortunately we cannot predict at present which target would fall into which category. Our aim at Task 1 is to decipher the factors determining the specificity of SpCas9 variants, which is an intriguing scientific question as well as it has important repercussions for their applications. It is equally puzzling that the Cas9 nucleases can theoretically cleave about 10^12 sequences, however, only a limited number of targets will be effectively cleaved, some remaining inefficiently or not at all cleaved in reality. Task 2 aims to understand this phenomenon. Although the efficiency of SpCas9 in case of some targets would allow for simultaneous multiple gene editing that would be important in understanding complex cellular pathways, in creating disease models, or in generating gene-KO cells in polyploid cell populations, the selection of the rare multiply-modified cells from the population is a very time-consuming and laborious task. A solution for this problem is aimed by Task 3.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
In this proposal our aim is to decipher the factors governing the on- and off-target activities of Cas9 nucleases and based on these to develop systems and strategies to accomplish a more accurate genome editing. The gathered knowledge on the activities and on the structural features of different nucleases and their targets will aid to reducing/eliminating the unwanted off-target effects of the nucleases. We consider of particular importance our method based on the self-cleaving guide-RNA library: employing a one million sequences-library, it provides much more complete information on the specificity of a given nuclease than those known by now. It may particularly be very useful for gaining more information on the less characterized and less used Cas9 nucleases that are known to be less efficient, though with less off-target hits than SpCas9, and may turn them into very useful nucleases for particular targets. We aim to develop several CRISPR-tools to solve difficulties not only encountered during our research but which are of widespread importance in several research areas. Our method of generating multiplex gene-edited cells provides a time-efficient and less laborious method, unavailable by now, for complex gene editing tasks such as here generating prion protein family gene-KO cells. Our results can have great use for the society in many areas like: the study of diseases by using model systems not available by now, development of humanized animal model systems for testing drugs, gene therapy applications, such as the reprograming of the immune system to kill cancerous cells, food industry or drug development, just to name a few. Our competitive advantages rely in the large amount of preliminary data we already gathered in a wide angle that make our tasks achievable in a shorter time.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
The discovery and the innovative implementation of the RNA-guided CRISPR-nucleases as a tool for genome editing have triggered an explosion of developments during the past years in molecular biology and related fields. Being a modular system with few key but alterable elements it provides possibility for its own retailoring to suite versatile needs. At present developing the palette and versatility of the CRISPR-based genome modification tools is a competitive field with spectacularly intense developments aiming to expand the areas of its applicability. Despite these, one of the major limitations of the CRISPR-based method is the appearance of off-target hits a reason that impedes its clinical use. Our aim in this proposal is to uncover the factors governing the specificity and off-target effects of Cas9-type nucleases and by these to develop new systems and methods to suite a more accurate genome editing, minimizing unwanted off-target hits. We are devoted not only to implement and base on the latest developments in the area but also to take advantage of advances in other fields, such as here it is the high content screening microscopy and automated cell-profiling that we combine with our own innovative ideas. The systems and methods to be developed here we plan to apply to study the functions of the prion family proteins that may have importance in the related conformational diseases. However, the knowledge gathered and the developed tools and methods may be utilized in various research applications, and are expected to greatly benefit both the national and international research community.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
