Proteolízis az idegrendszerben: a humán agyi tripszin szerkezetének és funkciójának vizsgálata
Angol cím
Proteolysis in central nervous system: investigationa of the structure and function of human brain trypsin
zsűri
Idegtudományok
Kutatóhely
Biokémiai Tanszék (Eötvös Loránd Tudományegyetem)
résztvevők
Gráf László Juhász Gábor Katona Gergely Kékesi Adrienna Katalin Pálhalmi János Szikra Tamás
projekt kezdete
2002-01-01
projekt vége
2005-12-31
aktuális összeg (MFt)
12.408
FTE (kutatóév egyenérték)
0.00
állapot
lezárult projekt
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
Klónoztunk a humán tripszinogén 4 teljes kódoló szekvenciáját. Bakterális expressziós rendszerben kifejeztük a két alternatív iniciációval keletkező izoformáját. Expresszáltuk és enzimatikusan karakterizáltuk az a tripszin 4-et. Meghatároztuk az aktív enzim benzamidin komplexének térszerkezetét. Feltérképeztük a mRNS és a fehérje eloszlását a humán agy 17 különböző régiójában. Vizsgáltuk az agyban előforduló potenciális szubsztrátjait. Megállapítottuk, hogy számos, a citoszkeletális váz felépítésében és regulálásában szereplő fehérje és a mielin bázikus fehérje szubsztrátja lehet a tripszin 4-nek. Izoláltuk a tripszinogén 4-et emberi agyszövetből és meghatároztuk amino terminális szekvenciáját. Tranziens szövettenyészetben megfelelően tervezett expressziós vektorok segítségével megállapítottuk, hogy az amino terminális leucin beépülését nem-konvencionális CTG iniciátor kodon irányítja. Meghatároztuk a tripszin – metilubellireril guanidinobenzoáttal történő reakciójának elemi sebességi állandóit. Vizsgáltuk számos természetes és szintetikus inhibitor gátló képességét, és valószínű magyarázatot adtunk arra, miért lehetetlen kanonikus mechanizmus alapján gátolni a tripszin 4-et.
kutatási eredmények (angolul)
We have isolated the complete coding sequence of human trypsinogen 4. In bacterial expression system we expressed and purified the two putative isoforms of the enzyme. We isolated the active enzyme as well, and characterized its enzymatic properties. We determined the X-ray structure of the trypsin 4 – benzamidine complex. By quantitative real time PCR and sandwich ELISA we determined the determined the distribution of the mRNA and protein in 17 different regions of the human brain. By sequencing the zymogen isolated from human brain we concluded that predominant form in the human brain possesses leucine amino terminus. Using human tissue cultures transiently transfected with appropriately designed expression vectors we proved that the incorporation of the amino terminal leucine is directed by a non-conventional CTG initiation codon. We determined the elementary kinetic constants of the trypsin 4 – methylumbelliferyl guanidine benzoate reaction. We studied the inhibitory potential of several natural and synthetic polypeptides, and we reasoned why is it impossible to inhibit trypsin 4 by a canonical inhibitor.
Medveczky P; Tóth J; Gráf L; Szilágyi L: On the structural cause of inhibitor resistance of human brain trypsin, In: 7th International Symposium on Protein Structure Function Relationship and Workshop on Characterization of Proteins, Karachi, 2003, pp 125-132, 2003
Biro A; Herincs Z; Fellinger E; Szilagyi L; Barad Z; Gergely J; Graf L; Sármay G: Charaterization of a trypsin-like serine protease of activated B cells mediating the cleavage of surface proteins, Biochim Biophys Acta 1624: 60-69, 2003
Kénesi E; Katona G; Szilágyi L: Structural and evolutionary consequences of unpaired cysteines in trypsin, Biochim Biophys Res Commun 309: 749-754, 2003
Gráf L; Szilágyi L: Trypsin: is there anything new under the Sun?, J Mol Struct-Theochem, 2003
Medveczky P; Gráf L; Szilágyi L: The effect of Arg193 on the enzymatic properties of human brain trypsin, In: Protein Science Vol 12 Suppl 1, 2003, p 98, 2003
Medveczky P; Siklódi E; Tóth J; Patthy A; Gallatz K; Németh P; Palkovits P; Gráf L; Szilágyi L: Trypsinogen 4 with a 28 amino acid leader peptide on its N-terminus is the predominant form of the enzyme in human brain, The FEBS Journal, Vol 272 , Supplement 1, p 164, 2005
Toth J, Gombos L, Simon Z, Medveczky P, Szilagyi L, Graf L,: Thermodynamic analysis reveals structural rearrangement during the acylation, J Biol Chem. 2006 Feb 21; [Epub ahead of print], 2006
Medveczky P, Antal J, Patthy A, Kekesi K, Juhasz G, Szilagyi L, Graf L.: Myelin basic protein, an autoantigen in multiple sclerosis, is selectively processed by human trypsin 4., FEBS Lett. 2006 Jan 23;580(2):545-52., 2006
Katona G; Berglund GI; Hajdu J; Gráf L; Szilágyi L: Crystal structure reveals basis for the inhibitor resistance of human brain trypsin, J Mol Biol 315:1209-12018, 2002
Fodor K, Harmat V, Neutze R, Szilagyi L, Graf L, Katona G.: Enzyme:substrate hydrogen bond shortening during the acylation phase of serine protease catalysis., Biochemistry. 2006 Feb 21;45(7):2114-21., 2006
