DNS (citozin-C5) metiltranszferázok szekvenciaspecifitása
Angol cím
Sequence-specificity of DNA (cytosine-5) methyltransferases
zsűri
Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely
Biokémiai Intézet (HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
résztvevők
Raskó Tamás Slaska-Kiss Krystyna
projekt kezdete
2002-01-01
projekt vége
2005-12-31
aktuális összeg (MFt)
12.164
FTE (kutatóév egyenérték)
0.00
állapot
lezárult projekt
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
1.) A SinI DNS-metiltranszferáz egyes mutánsai (N172S, V173L, N172S+V173L és L214S+Y229H) relaxált specifitást mutatnak, azaz a GGWCC szekvencia mellett a GGSCC szekvenciát is metilálják. Valamennyi eddig izolált, relaxált specifitást okozó mutáció az enzim feltételezett nagy doménjében található. Ez azt jelzi, hogy legalábbis a W vs. S megkülönböztetésben szerepe van a nagy domén és a kis árok közötti kölcsönhatásoknak is. Valamennyi vizsgált mutánsra jellemző a GGSCC szubsztráttal szembeni kcat érték jelentős megnövekedése.
2.) Klónoztuk két restrikciós endonukleáz (BspRI,GGCC; BepI, CGCG) génjét. A DNS szekvencia alapján a BspRI 317, a BepI 348 aminosavból áll. A gének átalakításával és expressziós vektorba ültetésével túltermelő klónokat hoztunk létre.
3.) Az SssI metiltranszferáz különböző variánsait állítottuk elő abból a célból, hogy terminálisan kovalens kötéssel oligonukleotidhoz kapcsolható legyen. A nemzetközi együttműködésben végzett munka célja egy „programozható” specifitású DNS metiltranszferáz kialakítása, melynek szelektivitását a kapcsolt oligonukleotid határozza meg.
kutatási eredmények (angolul)
1.) Some mutants of the SinI DNA methyltransferase (N172S, V173L, N172S+V173L and L214S+Y229H) display relaxed sequence specificity, i.e. methylate in addition to the GGWCC cognate sequence also the GGSCC sequence. All mutations so far isolated and resulting in relaxed specificity are located in the assumed large domain of the enzyme. This finding indicates that, at least in the discrimination between W and S, interactions between the large domain and the minor groove play a role. All mutants investigated are characterized by a large increase in the kcat values toward the GGSCC substrate.
2.) The genes of two restriction endonucleases (BspRI,GGCC; BepI, CGCG) have been cloned. Deduced from the DNA sequence, the BspRI endonuclease consists of 317 and the BepI of 348 amino acids. Over-expressing clones have been constructed by modifying the genes and cloning them into expression vectors.
3.) Different variants of the SssI methyltransferase were constructed with the aim to link the enzyme by terminal covalent coupling to oligonucleotides. The goal of the project done in international cooperation is to create a „programmable” DNA methyltransferase whose selectivity is determined by the coupled ologonucleotide.
Tungalag Chuluunbaatar, Tetiana Ivanenko-Johnston, Mónika Fuxreiter, Tamás Raskó, Joseph Heitman and Antal Kiss: Toxic phenotype of a cleavage impaired EcoRI-RsrI hybrid endonuclease, 5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Bristol, UK, Sept. 4-8, 2004, 2004
Tímár,E., Groma,G. Kiss, A. and Venetianer, P.: Changing the recognition specificity of a DNA-methyltransferase by in vitro evolution, Nucleic Acids Res. 32: 3898-3903, 2004
Monami, A., Kiss, A. and Weinhold, E.: Highly specific DNA methyltransferases, 5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Bristol, UK, Sept. 4-8, 2004, 2004
Roberts, R.J., Belfort, M., Bestor, T., Bhagwat, A.S., Bickle, T.A., Bitinaite, J., Blumenthal, R.M., Degtyarev, S.K., Dryden, D.T.F., Dybvig, K., Firman, K., Gromova, E.S., Gumport, R.I. et al.: A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes., Nucleic Acids Res. 31: 1805-1812., 2003
