A baktérium közösségek szerkezetéről molekuláris módszerekkel levont következtetések feltevése, hogy a vizsgálati lépések során a minta faj-abundancia viszonyai nem változnak. A kutatások ennek ellenkezőjét sugallják. Vizsgálataink a multitemplát PCR, ill. a klónkönyvtár készítés közösségszerkezet-torzító hatásait térképezte fel. A preferenciális amplifikációt bacteria specifikus primerekkel elemeztük, az annelációs hőmérséklet, ill. a ciklusszám hatására. Ismert genomú törzsek DNS keverékein a PCR termékek mennyiségi viszonyait TRFLP-vel vizsgáltuk. 1:1 arányú templátkeverékeknél az illeszkedési hibával bíró a tökéletesen illeszkedő templáttal szemben hátrányba került. Az aránytorzítás exponenciális összefüggést mutat az annelációs hőmérséklettel. A PCR ciklusszámnak elhanyagolható hatása van a PCR termékek arányaira. Környezeti minták vizsgálatai alapján javasoljuk a kis annelációs hőmérsékletek használatát a torzulások elkerülésére. A klónozás során fellépő preferenciális ligációt TA vektor segítségével vizsgáltuk. A 16S-23S spacer elemzésnél jellemző inzertméret különbségek esetén a klónkönyvtárak összetétele erősen eltolódott a rövidebb inzertek felé. Ha az inzertek csak szekvenciában különböztek, enyhe torzulást kaptunk. Vagyis a nagy hossz heterogenitású génszakaszokra épülő klónozásos vizsgálatoknál a rövidebb inzertet adó fajok túlreprezentáltak lesznek. A környezeti klónokból az első 12 faj izolálása (Bacteria és Archaea) megtörtént.
kutatási eredmények (angolul)
There are several biasing factors in molecular microbiological community analyses though the quantitative aspect of multitemplate PCR and ligation at clone library construction is poorly investigated. The biases were investigated using bacteria specific primers, focusing on the effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle numbers. The distortion of template-to-product ratio was measured using TRFLP analysis. At 1:1 genomic DNA template mixtures, primer mismatches presented serious bias, with preferential amplification of the template with perfectly matching sequence. The extent of preferential amplification showed exponential relation with increasing annealing temperatures. The number of PCR cycles had little influence on template-to-product ratios. Analysing environmental samples, the use of low annealing temperature was recommended to reduce preferential amplification. Blunt-end cloning ligation step was investigated for the insert length heretogeneity. Strong preferential ligation of the shorter PCR amplicon was shown. Slightly skewed ratios were detected at the same insert length and GC content. These findings indicate that members of a diverse microbial sample may be excluded during clone library construction because of preferential ligation, this way biasing the true community picture.Environmental clones detected by the optimised techniques were targeted to culture. 12 new species (Bacteria and Archaea) were isolated and partially characterised.
Sipos, R., Székely, A.J., Palatinszky, M., Révész, S., Márialigeti, K.Nikolausz, M.,: Effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle numbers on 16S rRNA gene targeting bacterial community analysis, FEMS Microbiol. Ecol., 2007
Nikolausz, M., témavezető Márialigeti, K.: Molekuláris biodiverzitás elemzési módszerek a környezeti mikrobiológiában és alkalmazásuk a rizoszféra-rizoplán mikrobaközösségek vizsgálatára., Doktori Értekezés. ELTE, TTK, Mikrobiológiai Tanszék, Budapest., 2003
Palatinszky, M., Nikolausz, M., Márialigeti, K.: Insert length and sequence heterogeneity as a biasing factor in clone library based community analysis, 2nd FEMS Congress, Abstract Book, 2007
Borsodi, A.K., Micsinai, A., Rusznyák, A., Vladár, P., Kovács, G., Tóth, E.M., Márialigeti, K.: Diversity of alkaliphilic and alkalitolerant bacteria cultivated from decomposing reed rhizomes in a Hungarian soda lake., Microb. Ecol. 50, 9-18., 2005
Pollák, B., Rusznyák, A., Palatinszky, M., Márialigeti, K., Borsodi, A.: Tiszántúli szikes tavak baktériumközösségeinek össehasonlító vizsgálata., Hibrol. Közl., 86, 88-90., 2006
Nikolausz, M., Sipos, R., Révész, S., Székely, A., Márialigeti, K.: Observation of bias associated with re-amplification of DNA isolated from denaturing gradient gels., FEMS Microbiol. Lett., 244, 385-390, 2005
Nikolausz, M., Márialigeti, K., Kovács, G.: Comparison of RNA- and DNA-based species diversity investigations in rhisoplane bacteriology with respect to chloroplast sequence exclusion, J. Microbiol. Meth., 56, 365-373., 2004
Nikolausz, M., Kappelmeyer, U., Székely, A., Márialigeti, K.. Kaestner, M.: Influence of diurnal redox fluctuation on microbial acssessment of parameters influencing quantitative biases of multitemplate PCR in molecular environmental microbiology, Acta Microbiol. Hung. Suppl., 2005
