A doménzáródás szerepe az aktív centrum kialakításában: irányított mutagenezis vizsgálatok a 3-foszfogicerát kinázon
Angol cím
Role of domain closure in formation of the active site geometry by site-directed mutagenesis of 3-phosphogycerate kinase
zsűri
Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely
MTA SzBK Enzimológiai Intézet
projekt kezdete
2004-10-01
projekt vége
2007-09-30
aktuális összeg (MFt)
18.203
FTE (kutatóév egyenérték)
0.00
állapot
lezárult projekt
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
A két doménból felépülő 3-foszfoglicerát kináz (PGK) doménzáródással működő enzim. Nem ismert, hogy mi a doménzáródás alapvető mozgató rugója, hogy miért szükséges mindkét szubsztrát egyidejű kötődése, és ez milyen molekuláris mechanizmussal indítja el a doménzáródást. Biofizikai módszerekkel és az ismert kristályszerkezetek összehasonlításával megállapítottuk, hogy miért stabilizálja bármelyik szubsztrát kötődése a másik domént és miért csak a terner komplexek esetében jön létre a zárt konformáció. A szubsztrátok együttes kötődése működteti a βL-ben elhelyezkedő kettős molekuláris kapcsolót. A konformációváltozások közvetítésében résztvevő interdomén-régió és a MgATP kötésében résztvevő konzervatív oldalláncokat irányított mutagenezissel Ala-ra cseréltem és kinetikai ill. biofizikai vizsgálatoknak vetettem alá. Megállapításaim: 1) Az R38 mellett a K215 is katalitikus oldallánc, mely a MgATP -foszfátjával együtt mozdul el és azt a megfelelő helyzetbe pozícionálja a katalízis és a doménzáródás során. 2) Nukleotid szubsztrát által kiváltott konformációs hatás molekulán belüli terjedésének mechanizmusában a K219 mellett az N336 és a E343 játszik kulcs szerepet. 3) A bL redő konzervatív S392, T393, valamint a környező F165, E192 és F196 oldalláncoknak is fontos szerepe van a 3-PG indította konformációváltozás továbbításában, azonban egyetlen vizsgált oldallánc sem felelős egyedül a molekuláris csukló működtetéséért, hanem ezek együttes kapcsolatrendszere szabályozza azt.
kutatási eredmények (angolul)
3-Phosphoglycerate kinase (PGK) is a two-domain hinge-bending enzyme with a well-structured interdomain region. The mechanism of domain–domain interaction, its regulation by substrate binding, the requirement of both substrates for binding and the mechanism of substrate assisted domain closure is not yet fully understood. Molecular graphical analysis of the known crystal structures and biophysical investigations have shown, that binding of either substrate stabilizes the other domain and binding of both substrates is essential for domain closure and also directs the operation of a double molecular switch at the L. Site directed mutations were designed at the MgATP binding site and the interdomain region: 10 conserved residues were changed to Ala and were investigated in functional and biophysical measurements. Main findings are: 1) K215 is a catalytic residue, like R38. This interacts with the g-phosphate of MgATP and assists in its proper positioning for the catalysis during domain closure. 2) The nucleotide site residues (K219, N336, E343) have essential role in the transmission of the nucleotide induced effect towards the main hinge. 3) S392 and T393 residues in bL and the surrounding F165, E192 and F196 are involved in transmission of the effects of 3-PG from one domain to the other. Neither of these side-chains is responsible alone for functioning of the molecular hinge at the βL, rather the cumulative effects of their multiple interactions operate in the hinge region.
Szabó, J., Varga, A., Flachner, B., Konarev, P., Svergun, D., Závodszky, P. & Vas, M.: Role of Side-chanes int he Operation of the Molecular Hinge of 3-Phosphoglycerate Kinase, FEBS Letters beküldve 2008 jan. 30, 2008
Szabó, J., Varga, A., Flachner, B., Konarev, P., Svergun, D., Závodszky, P. & Vas, M.: Communication Between the Nucleotide Site and the Main Molecular Hinge of 3-Phosphoglycerate Kinase, Biochemistry beküldve 2007 dec. 21., 2008
Flachner, B., Varga, A., Szabó, J., Barna, L., Hajdú, I., Gyimesi, G., Závodszky, P., Vas, M.: Substrate-Assisted Movement of the Catalytic Lys 215 During Domain Closure: Site-Directed Mutagenesis Studies of Human 3-Phosphoglycerate Kinase, Biochemisry 44 16853-865, 2005
Varga A, Flachner B, Konarev P, Graczer E, Szabo J, Svergun D, Zavodszky P, Vas M.: Substrate-induced double sided H-bond network as a means of domain closure in 3-phosphoglycerate kinase., FEBS Lett. 580(11):2698-706., 2006
Varga A, Flachner B, Graczer E, Osvath S, Szilagyi AN, Vas M.: Correlation between conformational stability of the ternary enzyme-substrate complex and domain closure of 3-phosphoglycerate kinase., FEBS J. 272(8):1867-85., 2005
Varga, A., Szabó, J., Flachner, B., Roy, B., Konarev, P., Svergun, D., Závodszky, P., Périgaud, C., Barman, T., Lionne, C. , Vas, M.: Interaction of human 3-phosphoglycerate kinase with l-ADP, the mirror image of d-ADP, Biochemical and Biophysical Research Communication 366: 994-1000, 2007
