A szekurin-szeparáz rendszer szerkezeti-funkcionális jellemzése  részletek

súgó  nyomtatás 
vissza »
 

Projekt adatai

  
azonosító
60694
típus K
Vezető kutató Tompa Péter
magyar cím A szekurin-szeparáz rendszer szerkezeti-funkcionális jellemzése
Angol cím Structural and functional characterisation of the securin-separase system
magyar kulcsszavak szekurin, szeparáz, rendezetlen fehérje, sejtciklus szabályozás
angol kulcsszavak securin, separase, intrinsically unstructured protein, regulation of cell cycle
megadott besorolás
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)100 %
zsűri Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely MTA SzBK Enzimológiai Intézet
résztvevők Csizmók Veronika
Kovács Sándor Dénes
Némethné Szabó Beáta
Ságiné Házy Eszter
Szőllősi Edit
Tompa Kálmán
projekt kezdete 2006-02-01
projekt vége 2010-01-31
aktuális összeg (MFt) 20.000
FTE (kutatóév egyenérték) 8.21
állapot lezárult projekt
magyar összefoglaló
A rendezetlen fehérjék funkcionális állapotukban sem rendelkeznek kitüntetett térszerkezettel, ugyanakkor képesek lehetnek ugyanazt a partner molekulát gátolni és aktiválni is. A szekurin, az anafázist elindító szeparáz rendezetlen inhibítora és aktivátora evolúciósan rendkívül változékony, és működési elégtelensége sejtosztódási hibákat és így rákot okozhat. Szeparázzal való kölcsönhatásait eddig még nem jellemezték részletesen.
Pályázatom alapgondolata ezért a szekurin-szeparáz rendszer szerkezet-funkció összefüggéseinek feltárása, az alábbi konkrét feladatok megvalósításán keresztül:

1. Az ecetmuslica szeparáz (SSE) klónozása és jellemzése.
2. Az élesztő (Pds1p), ecetmuslica (PIM) és humán (PTTG1) szekurin klónozása és részletes szerkezeti vizsgálata.
3. A szekurin-szeparáz kölcsönhatás jellemzése a háromféle szekurinnal, azok fragmenseivel és mutánsaival in vitro. Az eredmények szerkezeti adatokkal történő összevetése.
4. Szekurinok és mutánsaik bevitele a szekurint nem tartalmazó (csendesített) muslica sejtvonalba, a szekurin-szeparáz kölcsönhatás vizsgálata in vivo.

Eredményeink révén várhatóan közelebb kerülhetünk a rendezetlen fehérjék szerkezet-funkció összefüggéseinek megértéséhez. Értelmezhetjük a funkció változatlansága és a fehérje nagymértékű változatossága közötti (látszólagos) ellentmondást, valamint az ambivalens (aktiváló-gátló) hatás szerkezeti hátterét. A szeparáz szabályozásának pontos feltérképezése a terápiás beavatkozások lehetőségét is megteremtik.
angol összefoglaló
Intrinsically unstructured proteins (IUPs) lack a well-defined 3D structure and may be able to activate and inhibit their partner molecule due to complex patterns of interaction. Securin, the unstructured inhibitor and activator of separase, the protease that initiates anaphase in mitosis, shows large evolutionary variability and causes aneuploidity and cancer when mutated. Its interaction with separase has not been characterized in detail.
The main goal of my proposal is to elucidate the structure-function realtionship of the securin-separase system, via the following specific aims:

1. Cloning and characterization of Drosophila separase (SSE).
2. Cloning and detailed structural characterization of yeast (Pds1p), fly (PIM) and human (PTTG1) securins.
3. Detailed characterization of the securin-separase interaction with full-length securins, their fragments and mutants.
4. Silencing of securin in Drosophila S2 cells and their transfection with various securin constructs to characterize the securin-separase interaction in vivo.

Via these experiments, we hope to gain a deeper insight into the structure-function relationship of IUPs. We expect that the apparent contradiction between conserved function and sequential variability can be resolved and the structural background of the ambiguous inhibitory/activatory effects can be elucidated. A better understanding of the control of separase action may also enable the develoment of novel treatments against securin malfunction.




 

Zárójelentés

  
kutatási eredmények (magyarul)
A munkaterv azt a célt tűzte ki, hogy a sejtciklusban fontos szerepet játszó szeparáz enzim és rendezetlen inhibítora (szekurin) részletes szerkezeti elemzésén keresztül közelebb jutunk a rendezetlen fehérjék funkciójának jobb megértéséhez. Ezen tervek nagyrészt megvalósultak, elsősorban a humán szekurin klónozását, és részletes szerkezeti jellemzését sikerült megoldanunk, ezen eredményeket két cikkben publikáltuk. Elkészültünk többféle szekurin (S. cerevisiae, D. melanogaster és humán) összehasonlító szerkezeti vizsgálatával is, ezen eredmények publikációja folyamatban van. A szeparáz enzim katalitikus doménjének klónozása sikerült, nagyszámú konstrukció készült és több is jól kifejeződő fehérjét eredményezett, amelyek aktivitását azonban nem tudtuk mérni. A munkát folytatjuk, folyamatban van egyrészt a fehérje különböző körülmények közötti kifejezése, denaturációja és renaturációja, és aktív formában való előállítása, másrészt nemzetközi együttműködésben Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) az ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) könyvtár-szűrési technika alkalmazása oldható és aktivitást mutató szeparáz konstrukció létrehozására. A fehérjék szerkezeti rendezetlenségének vizsgálata eközben számos más területeken is hatékonyan folyt, az OTKA K60694 pályázat támogatásának összesen 19 publikáció jelent meg.
kutatási eredmények (angolul)
The main goal of the proposed work was the detailed structure-function characterization of separase, a key enzyme in cell-cycle regulation and its intrinsically disordered inhibitor, securin. We planned to clone and isolate the two proteins, characterize their structure and interaction with particular focus on the disordered structural state of securin. We achieved part of this goal, mostly the cloning, expression and structural characterization by NMR of human securin, which was published in two papers. We also completed the comparative structural study of three different securins (S. cerevisiae, D. melanogaster and human), which is under publication. We managed to clone and express several constructs of the catalytic domain of separase, which resulted in soluble forms of the protein, without enzymatic activity, though. We continue this research by varying expression conditions, including denaturation-renaturation cycles to produce active separase, and also by an international collaboration with Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) with the application of the ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) technique in order to generate enzymatically active separase. Besides studies on the securin-separase system, we have carried out many other lines of productive research on intrinsically disordered proteins with the help of OTKA K60694 grant: we published 19 papers with acknowledging the grant.
a zárójelentés teljes szövege https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=60694
döntés eredménye
igen





 

Közleményjegyzék

  
Dosztányi, Zs., Chen, J., Dunker, A. K., Simon, I. and Tompa, P.: Disorder and sequence repeats in hub proteins and their implications for network evolution, J. Proteome Res. 5, 2985-2995, 2006
Tompa, P., Dosztányi, Zs. and Simon, I.: Prevalent structural disorder in E. coli and S. cerevisiae proteomes, J. Proteome Res. 5, 1996-2000, 2006
Dosztányi, Zs., Sándor, M., Tompa, P. and Simon, I.: Prediction of protein disorder at the domain level, Curr. Prot. Pept. Sci. 8, 161-171, 2007
Fuxreiter, M., Tompa, P. and Simon, I.: Local structural disorder imparts plasticity on linear motifs, Bioinformatics, 23, 950-956, 2007
Mészáros, B., Tompa, P., Simon, I. and Dosztányi, Zs.: Molecular principles of the interactions of disordered proteins, J. Mol. Biol. 372, 549-61, 2007
Hegyi, H., Schád, E. and Tompa, P.: Structural disorder promotes assembly of protein complexes, BMC Struct. Biol. Epub ahead of print, 2007
Dosztányi, Zs., and Tompa, P.: Prediction of protein disorder., Methods Mol. Biol. 426, 103-115, 2008
Szőllősi, E., Bokor, M., Bodor, A., Perczel, A., Klement, E., Medzihradszky, K. F., Tompa, K., and Tompa, P.: Intrinsic structural disorder of DF31, a Drosophila protein of chromatin decondensation and remodeling activities., J. Proteome Res. 7, 2291-2299, 2008
Tompa, P., Prilusky, J., Silman, I. and Sussman, J.: Structural disorder serves as a weak signal for protein degradation within the cell, Proteins 71, 903-909, 2008
Tompa, P. and Fuxreiter, M.: Fuzzy complexes: polymorphism and structural disorder in protein-protein interactions, Trends Biochem. Sci. 33, 2-8, 2008
Hegyi, H. and Tompa, P.: Intrinsically disordered proteins display no preference for chaperone binding in vivo, PLoS Comput. Biol. 4, e1000017, 2008
Kovács, D., Kalmár, É., Török, Zs. and Tompa, P.: Chaperone activity of ERD10 and ERD14, two disordered stress-related plant proteins, Plant Physiol. 147, 381-390, 2008
Kiss, R., Kovács, D., Tompa, P. and Perczel, A.: Local structural preferences of calpastatin, the intrinsically unstructured protein inhibitor of calpain, Biochemistry. 47, 6936-6945, 2008
Kiss, R., Bozoky, Z., Kovács, D., Róna, G., Friedrich, P., Dvortsák, P., Weisemann, R., Tompa, P. and Perczel, A: Calcium-induced tripartite binding of intrinsically disordered calpastatin to its cognate enzyme, calpain, FEBS Lett., 82, 2149-2154, 2008
Tusnády, G.E., Kalmár, L., Hegyi, H., Tompa, P. and Simon, I.: TOPDOM: database of domains and motifs with conservative location in transmembrane proteins, Bioinformatics, 24, 1469-1470, 2008
Kovacs, D., Agoston, B., and Tompa, P.: Disordered plant LEA proteins as molecular chaperones, Plant Sign. Behav. 3, 710-713, 2008
Fuxreiter, M., Tompa, P., Simon, I., Uversky, V.N. Hansen, J.C. Asturias, F.J.: Malleable machines take shape in transcriptional regulation, Nat. Chem. Biol. 4, 728-737, 2008
Csizmok, V., Felli, I., Tompa, P., Banci, L. and Bertini, I.: Structural and dynamic characterization of intrinsically disordered human securin by NMR, J. Am. Chem. Soc. 130, 16873-16879, 2008
Bermel, W., Bertini, I., Csizmok, V., Felli, I.C., Pierattelli, R. and Tompa, P.: H-start for exclusively heteronuclear NMR spectroscopy: the case of unfolded proteins, J. Magn. Res. 198, 275-281, 2009



vissza »