Mikrobiológia: virológia, bakteriológia, parazitológia, mikológia (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
100 %
zsűri
Immun-, Tumor- és Mikrobiológia
Kutatóhely
Gyógyszeranalitikai Intézet (Szegedi Tudományegyetem)
résztvevők
Kalmár Éva Oláh Zoltán
projekt kezdete
2009-04-01
projekt vége
2011-03-31
aktuális összeg (MFt)
29.530
FTE (kutatóév egyenérték)
2.98
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
A penicillin felfedezése és az antibiotikumok széles körű használata a 20. század talán egyik legnagyobb vívmánya volt. Az elmúlt évtizedek alatt azonban több antibiotikum hatástalanná vált a baktériumokban bekövetkezett evolúciós változások miatt, melyek a baktériumok túléléséért felelősek. A multidrog rezisztens (MDR) transzport fehérjék kritikus kimenettel lehetnek egy fertőző betegség kezelése során azáltal, hogy képesek az adott gyógyszert a sejtekből kipumpálni. Ezek a fehérjék a sejtmembránba ágyazottan helyezkednek el és fő feladatuk sokféle szubsztrát megkötése és kiszállítása a sejtből. Néhány MDR esetében már ismert a nagyfelbontású szerkezet, de ezek a példák nem nyújtanak elegendő információt a multidrog rezisztencia jelenség pontos leírásához. Escherichia coli-ban a legfőbb antibiotikum rezisztenciáért az AcrB fehérje felelős, mely folyamatosan expresszálódik és ezzel egy alap rezisztenciát biztosít a mikroorganizmusnak. Az AcrB két másik fehérjével lép kölcsönhatásba a működése során: a TolC-vel, mely egy külső membránfehérje, és az AcrA-vel, mely sejtmembránhoz láncolt protein. Az így kialakult fehérje komplex egy csatornát képez a belső és külső membránban áthidalva periplazmatikus teret, és ezen a csatornán keresztül távolítja el a nemkívánatos molekulákat. Az AcrB molekula háromdimenziós szerkezetét és működését Murakami és Seeger egymástól függetlenül írta le. A pályázat fő célkitűzése különböző Gram negatív baktériumok AcrB homológ MDR transzport fehérjéinek klónozása, expresszálása, funkcionális vizsgálata, tisztítása, kristályosítása majd később a szerkezetük meghatározása.
angol összefoglaló
The discovery of penicillin and the widespread use of antibiotics to control infectious disease has been one of the most important innovations of the 20th century. However during the last decades several available antibiotics became ineffective due to evolutionary changes in bacteria that allow them to survive these powerful drugs. Multidrug resistance efflux transporters (MDR) threaten to reverse the progress of treating infectious disease by extruding a wide range of drug and other cytotoxic compounds. These proteins are embedded in the cell membrane and their function is to bind and transport a broad range of substrate out of the cell. Yet high resolution structures of multidrug resistant proteins have been solved, however those examples do not provide enough information to describe thoroughly the mechanism of multidrug resistance. AcrB is a principal multidrug exporter expressed almost constitutively and confers intrinsic drug tolerance to Escherichia coli. It cooperates with both an outer-membrane channel, TolC, and a membrane-fusion protein, AcrA, and exports a wide variety of toxic compounds directly out of the cell by bypassing the periplasm. The structure of AcrB and the detailed mechanism of action were determined by Murakami and Seeger independently. The major focus of this project is to clone, over-express, functionally characterize, purify, crystallize and later solve the structure of AcrB homologue MDR transporters from different bacteria.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
Különböző AcrB homológ fehérjéket vizsgáltunk. Kettő a Brucella melitensis baktériumban kódolt (BMEI 1645, BMEI 0895) egy-egy pedig Haemophilus influenzae-ban (HI 0895). Acinetobacter baumannii-ban (ACIAD0783), Pseudomonas aeruginosa-ban (PA0158), Pectobacterium carotovorum-ban (ECA1169), Helicobacter pylori-ban (HP0607), Klebsiella pneumoniae-ban (KPN00443) valamint Bacillus cereus törzsekből: Bacillus cereus ATCC 10987 (BCE 0788), és Bacillus cereus ATCC 14579 (BC0714). Sikeres klónozást a következő gének esetén értünk el: BMEI 1645, BMEI 0895, HI 0895, BCE 0788, BC0714. A felsorolt gének közül a BMEI 1645-ös fehérje over-expresszálódott egyedül Escherichia coliban. Ezt a fehérjét szolubilizáltuk, tisztítottuk affinitás oszlopon, majd gélszűréssel. A fehérje két fő populációt mutatott a gélszűrés eredményként, melyeket jellemeznünk szükséges a fehérje kristályosítása előtt.
Az AcrB fehérjét, mint kontrolt, sikeresen klónoztuk, expresszáltuk Escherichia coliban, nagy mennyiségben tisztítottuk és kristályosítottuk. A kristályosítás során ß-peptid foldamerek hatását vizsgáltuk és megállapítottuk, hogy a kristályosítás során segédanyagként használt foldamer megkönnyíteni, lerövidíteni látszik kristályosításhoz szükséges időt.
kutatási eredmények (angolul)
Different AcrB homologue transporters were examined. Two of them are coded in Brucella melitensis (BMEI 1645, BMEI 0895), one each is coded in Haemophilus influenzae (HI 0895). Acinetobacter baumannii (ACIAD0783), Pseudomonas aeruginosa (PA0158), Pectobacterium carotovorum (ECA1169), Helicobacter pylori (HP0607), Klebsiella pneumoniae (KPN00443) and two of them from different Bacillus cereus strains Bacillus cereus ATCC 10987 (BCE 0788) and Bacillus cereus ATCC 14579 (BC0714). The following genes were successfully cloned: BMEI 1645, BMEI 0895, HI 0895, BCE 0788, BC0714. BMEI 1645 protein was overexpressed in Escherichia coli. The protein was solubilized and purified by affinity chromatography and size exclusion chromatography. Two major populations of protein were observed after size exclusion chromatography and those need to be characterized before protein crystallization.
AcrB protein as a control was successfully cloned, expressed in Escherichia coli, purified in large scale and crystallized. The effect of a ß-peptid foldamer was investigated and we determined that the ß-peptid foldamer as a crystallization adjuvant might help to decrease the time necessary for crystal formation.
Marton Lívia, Róna Gergely, Mészáros Ádám, Szakonyi Gerda, Márki-Zay János: Investigation of transporter interactions of antimalarials, Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Társaság 55. Nagygyűlése, Pécs, 2010. 08.26-28., 2010
Saidijam M, Bettaney KE, Leng D, Ma P, Xu Z, Keen JG, Rutherford NG, Ward A, Henderson PFJ, Szakonyi G, Ren Q, Paulsen IT, Nes I, Kroeger JK, Kolsto A: The MFS efflux proteins of Gram-positive and Gram-negative bacteria., . In: Advences in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, ed. Toone EJ. John Wiley & Sons Inc. pp. 147-166., 2011
