Drosophila, ecdysone production, ring gland, supression, hieraechy of regulation
megadott besorolás
Sejtgenetika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
60 %
Ortelius tudományág: Molekuláris genetika
Epigenetika és génszabályozás (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
40 %
zsűri
Sejt- és Fejlődésbiológia
Kutatóhely
Genetikai Tanszék (Szegedi Tudományegyetem)
résztvevők
Ádám Géza Gausz János Huszár Tünde Ildikó Takács Sándor Török Tibor
projekt kezdete
2009-09-01
projekt vége
2014-03-31
aktuális összeg (MFt)
28.503
FTE (kutatóév egyenérték)
4.34
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
Az mld gén mutánsainak fejlődési zavarát az ekdizon hiány okozza. Az mld gén a lárva gyűrű mirigyben (RG) fejeződik ki és az ekdizon (E) termelés központi szereplője. Szomatikus mozaikok segítségével megvizsgáljuk, hogy az mld nagy-RG fenotípus nem-autonóm viselkedése hogyan függ az ekdizon jelátviteltől. Csíravonal mozaikokkal vizsgáljuk az mld maternális hatását. Feltárjuk az mld szerepét az ekdizon bioszintézis szabályozásában. Az MLD izoformái DNS kötő motívumokat viselnek. Abból a célból, hogy a szabályozási hálózatot megismerjük, MLD specifikus ellenanyag segítségével, ChIP technikával azonosítjuk az MLD cél géneket. Az ekdizon bioszintézis enzimei közül csak egy (dare) kifejeződése függ az mld-től. A cél gének dózisának változtatásával (deléciók, duplikációk) kiváltott fenotípusok elemzésével, hormonkezeléssel és közvetlen hormon meghatározással ellenőrizzük a kapcsolatok valós voltát. Az MLD-A izoforma dimerizációs domént is visel. Az izoformák teljes és csonkolt transzkriptjeinek felhasználásával élesztő kéthibrid (Y2H) kísérletekben azonosítjuk az MLD kölcsönható partnereit. A kölcsönhatás valódiságát immunprecipitációval ellenőrizzük. Szöveti transzkript hibridizációval vizsgáljuk, hogy az azonosított partner megnyilvánul-e a RG-ben. Kettős mutánsokban genetikailag ellenőrizzük a kölcsönhatás természetét. Az mld hőérzékeny funkciónyeréses allél felhasználásával domináns szupresszor, Su(mld) mutációkkal telítjük a 2. és a 3. kromoszómát. A genetikailag azonosított kölcsönható partnereket összevetjük az Y2H kísérletek eredményeivel. Az azonosított célgének, kölcsönható partnerek és az mld-t szabályzó gének viselkedéséből felállítjuk az ekdizon termelés mld függő modelljét. Az mld nagy-RG fenotípus felhasználásával feltárjuk a sejt növekedési faktorok és az E jelátvitel közötti kapcsolat természetét.
angol összefoglaló
The developmental arrest of molting defective (mld) mutants resulted in the lack of ecdysone (E). mld is expressed in the RG, and a central player of the ecdysone production. The role of ecdysone signaling in the large-RG phenotype of mld will be clarified by the use of different EcR-RNAi constructs. In germ line mosaics the maternal effect of mld will be tested. The role of mld in the ecdysone production will be studied. The MLD isoforms bear DNA binding domains. In order to understand the regulatory network, the mld targets will be identified with MLD specific antibody in ChIP experiments. Among genes involved in E synthesis, only dare proved to be mld dependent. Therefore we expect mld targets not directly participating in the synthetic steps. The putative targets will be verified by altering the gene dosage with deletions and duplications, hormone treatment or direct hormone titrations. Concentration on the dimerization domain of MLD-A isoform, truncated and full length coding sequences of mld will be used in yeast two-hybrid (Y2H) experiments with Drosophila cDNA library, to identify mld interacting partners. The interactions will be verified by immunoprecipitation. The expression of partners in the RG will be monitored by in situ transcript hybridization. The nature of the interaction will be tested in double mutants. New mutations suppressing mldDTS3 phenotype (Su(mld)) will be isolated to chromosome 2 and 3. These will be mapped and identified. The genetic supressors and Y2H partners will be compared for overlaps. From the behavior of target, interacting and regulatory genes of mld, a model of regulation of the ecdysone production will be constructed. The hypertroph ring gland phenotype of mld will be exploited to study the crosstalk between cell growth factors and E signaling.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
Az l(3)DTS-3 mutáció az mld gén antimorf alléljának bizonyult. Az mld zigótikus gén, funkciója a muslica embrióban nélkülözhető, de a lárvában nélkülözhetetlen. Az mld funkciója az ekdizon (E) szintézishez korai szakaszához nélkülözhetetlen, a 7dH-koleszterin és a ketodiol átalakulásban szükséges. Genetikai mozaikokkal igazoltuk, hogy nem-autonóm módon gátolja a RG politenizációtját. Az E szintézis gátlása és az EcR csendesítése is nagy RG-et okoz. Az mld a RG növekedését az EcR-en keresztül gátolja. Az Mld ellenanyag a nyálmirigy kromoszóma legtöbb sávját festi. Az E bioszintézis gének RNS szintje nem különbözik jelentősen az mld mutánsban és a vad típus között. Ezekből arra következtetünk, hogy az mld nem, vagy nemcsak a Halloween gének közvetlen szabályzója. Az mld mutánsokban a PEV fokozódását tapasztaltuk. Azt is tapasztaltuk, hogy a HAT aktivitás farmakológiai gátlása menekíti az mld[DTS-3] lárva letalitást. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy az mld a kromatin szerkezetre hat. Az egyik Y2H rendszerben azonosított Mld kölcsönható partner CG11275 egy BTB/POZ domént hordozó potenciális korepresszor. A DTS-3 fenotípust szupresszáló mutánsokat azonosítottunk EMS mutagenezis kísérletben. A szupresszorok között nem találtunk Halloween géneket. Az mld-vel genetikailag kölcsönható gének (not, jumu, gfzf) közös funkciója a kromatin módosítás. Ezek és a HAT komplexet kötő CG11275 arra utalnak, hogy az mld az E szintézisre a kromatin módosításán át, közvetve hat.
kutatási eredmények (angolul)
We showed, l(3)DTS-3 mutation is an antimorph allele of the mld gene. Mld is a gene with zygotic nature, its function is needed for the larva development. Mld acts on ecdysone production of the RG. In mld mutants E biosynthesis is stalled in between 7dH-kolesterol and ketodiol. In genetic mosaics we found the giant RG phenotype is not cell autonomous. The large RG phenotype can be photocopied by pharmacological inhibition of E production and by silencing EcR in the RG. We suggest mld is an inhibitory factor of RG polytenization acting via EcR. Mld antibody stains most of the bands of giant chromosome. The expressions of Halloween genes are not altered in mld mutants. We found PEV is enhanced in mld mutants. Inhibition of HAT activity suppresses mld[DTS-3] larva lethality. From these we suggest mld acts upon chromatin structure. One of the partners interacting with Mld N-terminal part in Y2H is CG11275, a potential corepressor with BTB/POZ domain. We have identified suppressors of DTS-3 phenotype in EMS mutagenesis experiments. Among the suppressors, again, the Halloween genes were not represented. The chromatin modification seems to be a common function of the suppressor genes. Mld protein appears to be present in a great number of locations along the polite chromosome. The function of Mld interacting partners (CG11275, not, jumu, gfzf) suggest chromatin modifying function. These observations we conclude Mld acts on E production via epigenetic modification of chromatin.
Tomisa Bernadett, Maróy Péter: Az ekdizon termelésben résztvevő molting defective gén jellemzése, SzTE Biológia Doktori Iskola Konferencia, 2012
Dosztig Monika, Maróy Péter: Második kromoszómás domináns DTS-3 szupresszorok izolálása, Genetikai Tanszék, SzTE, labor szeminárium, 2012
Huszár Tünde, Maróy Péter: l(3)mld[DTS3]al kapcsolatos munkák, eredmények, SzTE, Genetikai Tanszék, tanszéki szeminárium, 2012
Takács Sándor, Maróy Péter: mld ellenanyagok, jók - nem jók?, Genetikai Tanszék, SzTE, csoport szeminárium, 2012
Maróy Péter, Tomisa Bernadett: DTS-3 szupresszorok adatainak összegzése, szórások és termosztát hőmérséklet, Genetikai Tanszék, SzTE, csoport szeminárium, 2013
Dosztig, M., Tomisa, B., Maróy, P.: mld/DTS-3 gene is zygotic and regulates ecdysone production in the larvae, Molekuláris Élettudományi Konferencia, Siófok, 2013
Maróy Péter: Brain Enhancere könyvtár és Starr-seq, újszerű lehetőségek a szabályozó szakaszok azonosításában, Genetikai Tanszék, SzTE, csoport szeminárium, 2014
