A kromatinszerkezet és a génműködés in situ tanulmányozása a Drosophila melanogaster Ubx doménjében
Angol cím
In situ study of chromatin structure and gene expression in the Ubx domain of Drosophila melanogaster
magyar kulcsszavak
Kromatinszerkezet, epigenetikus szabályozás, Drosophila, homeotikus gének, Polycomb Response Elemek
angol kulcsszavak
chromatin structure, epigenetic regulation, Drosophila, homeotic genes, Polycomb Response Elements
megadott besorolás
Sejtgenetika (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
60 %
Ortelius tudományág: Molekuláris genetika
Epigenetika és génszabályozás (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
40 %
zsűri
Genetika, Genomika, Bioinformatika és Rendszerbiológia
Kutatóhely
Genetikai Intézet (HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont)
résztvevők
Bajusz Izabella Gyurkovics Henrik Mihály József Nagy Andrea
projekt kezdete
2011-05-01
projekt vége
2015-10-31
aktuális összeg (MFt)
31.993
FTE (kutatóév egyenérték)
7.47
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
Drosophilában a Polycomb csoportba tartozó fehérjék számos, az egyedfejlődésben kulcsszerepet játszó gén inaktív kromatinszerkezetének fenntartásában vesznek részt. Ez a szabályozási mechanizmus és a résztvevő faktorok evolúciósan konzerváltak. A Polycomb gének hosszú távú gátló hatása a célgének kromatinszerkezetének tömörödésével jár. A POLYCOMB fehérjék gátló hatásukat kitüntetett DNS szakaszokhoz kötődve fejtik ki, melyeket Polycomb Response Elemeknek vagy PRE-knak nevezünk. Noha a PRE-król ismert, hogy egymással nagy távolságból is képesek kölcsönhatásba lépni, a PRE-kat ezidáig szinte kizárólag csak transzgenikus konstrukciókban vizsgálták. Csoportunk kifejlesztett egy új típusú génkonverziós eljárást, amely egyedülálló módon lehetővé teszi, hogy a PRE-kat az eredeti helyükön módosíthassuk, és ott tanulmányozhassuk működésüket. A jelen kutatási munkatervben a bxd PRE in situ tanulmányozásának folytatására teszünk javaslatot, illetve ki akarjuk terjeszteni vizsgálatainkat a környező cisz-hatású elemekre (egy TRE-ra és két korai enhanszerre) is. Az epigenetikus represszor rendszerek közötti funkcionális hasonlóság bizonyítására helyettesítjük a bxd PRE-t az első egérben azonosított PRE-val. Továbbá, hogy tanulmányozhassuk a PRE-k közötti kölcsönhatásokat, in situ szeretnénk definiálni, majd a bxd PRE-val egyidejűleg eltávolítani a bithorax régióban található PRE-t is. Kísérleteinkben csak kismértékű kockázat rejlik, hiszen az összes tervezett vizsgálati módszert már korábban sikeresen alkalmaztuk. Várható eredményeink nagymértékben kibővíthetik a magasabbrendű kromatinszerkezet és génműködés epigenetikus szabályozáról rendelkezésünkre álló ismereteket.
angol összefoglaló
In Drosophila, the maintenance of repressed chromatin states of many developmentally important genes is accomplished by interacting proteins of the Polycomb group genes. Homologous proteins are found in mammals, where they appear to have analogous functions. The long term repression by the Polycomb group genes is accompanied by a change in chromatin structure, making it less accessible to transcription factors and polymerases. POLYCOMB proteins act through DNA-sites called Polycomb Response Elements or PREs. Although PREs are known to interact with each other over large distances, they were studied mostly in transgenic constructs inserted into random sites of the Drosophila genome. Because of technical limitations, PREs have not been recognized or studied in their original location and context. However, we have recently developed a novel method of gene conversion, which made uniquely possible and convenient to dissect PREs, and to follow their functioning in situ. In the present application we propose to continue our in situ studies in the bxd PRE and extend it to neighboring cis-acting elements (a TRE and two early enhancers). We also propose to use the first mammalian PRE in our in situ assay to test the functional similarity between the fly and the mammalian silencing systems. In addition, to study communications between PREs, we plan to dissect in situ the PRE in the bithorax cis-regulatory region. Only a very low level of risk of failure is associated with the planned experiments, since we have already successfully used all the techniques that will be applied. We believe that the proposed experiments can substantially increase our knowledge about the epigenetic regulation of higher order chromatin structure and gene expression.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
I. A bxd PRE és környezete in situ funkcionális analízise.
A 185 bp-os bxd PRE magját kicserélve más, nem a BX-C-ből származó PRE-kra megállapítottuk, hogy:
- a BX-C PRE-ktől eltérő számú és elrendezésű GAGA és PHO kötőhelyeket tartalmazó PRE-k is képesek helyettesíteni a 185 bp-os bxd PRE magját
- az ismert kötőhelyeken kívüli más, ismeretlen kötőhelyek is szükségesek
- mesterségesen összerakott PRE-mag is képes a helyettesítésre
- a két emlős-PRE nem képes együttműködni a szomszédos PRE-hatású régiókkal, interferál azok működésével
Hat, a bxd TRE-t részlegesen illetve teljesen eltávolító deléciót azonosítottunk. Bár e deléciós egyedek repülőképessége jelentősen lecsökkent, a deléciók fenotípusosan nem rontják az Ubx gén működését. A lokálisan beépített markergén kifejeződése azonban a csak TRE-t eltávolító deléciókban lecsökkent.
A korai S2 embrionális enhanszert eltávolító deléció megakadályozza a PRE-hiányában bekövetkező Ubx-derepressziót és az ebből adódó domináns fenotípus kialakulását. Önmagában az S1 és S2 enhanszerek hiánya nem okoz fenotípusos változást, de jelentősen lecsökkenti a repülőképességét. Lokálisan beépített riportergén révén kimutattuk, az S1 enhanszert tartalmazó régió gyenge PRE-ként is viselkedik.
II. A bxd régióval szomszédos bx régióban található PRE-ból eltérő méretű szakaszokat távolítottunk el. Bár a lokálisan beépített riportergén expressziója ektópikussá vált, nem észleltünk ennek megfelelő homeotikus transzformációkat.
kutatási eredmények (angolul)
I. In situ functional study of the bxd PRE and its neighborhood
Replacing the 185 bp bxd PRE core with other, non-BX-C PREs we found that:
- PREs containing GAGA and PHO binding sites in number and array other than BX-C PREs, can also functionally substitute the bxd PRE core
- sequences other than GAGA and PHO sites are also necessary for PRE function
- an artificially engineered PRE core can work as well
- PREs found in mammals can not cooperate with PRE-modules flanking the core
We have generated six different deletions removing only partially or fully the bxd TRE. Although these deletions significantly impair the flight capability of flies, they do not reduce detectably the functioning of the Ubx gene. However, deletions removing only the TRE do reduce the expression of a reporter gene integrated locally.
Deletions removing the early acting S2 enhancer prevent derepression of the Ubx gene and dominant phenotypes observed in the lack of the bxd PRE. Although clean deletions of the S1 and S2 enhancer regions reduce significantly the flight ability, they do not cause detectable phenotypes. Using a locally integrated reporter gene, we show that S1 behaves as a weak PRE.
II. We have removed different regions of the PRE found in the bx cis-regulatory region neighboring bxd. Although some of these deletions resulted in the derepression of a locally integrated reporter gene, loss of these regions did not cause posteriorly directed homeotic transformations.
