Biológiai fizika (Műszaki és Természettudományok Kollégiuma)
60 %
Szerkezeti biológia (krisztallográfia és elektronmikroszkópia) (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
30 %
Általános biokémia és anyagcsere (Orvosi és Biológiai Tudományok Kollégiuma)
10 %
Ortelius tudományág: Molekuláris markerek és azonosításuk
zsűri
Molekuláris és Szerkezeti Biológia, Biokémia
Kutatóhely
Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet (Semmelweis Egyetem)
résztvevők
Bulyáki Éva Fekete Melinda Haracska Lajos Kardos József Kellermayer Miklós Sándor Zoltán Mártonfalvi Zsolt Pongor Csaba István Schay Gusztáv Tölgyesi Ferenc Vass Koppány Csaba Veres Dániel Zséli Györgyi
projekt kezdete
2011-02-01
projekt vége
2015-01-31
aktuális összeg (MFt)
19.981
FTE (kutatóév egyenérték)
11.47
állapot
lezárult projekt
magyar összefoglaló
A sejtek genetikai állományának őrzését speciális fehérjék együttese végzi, amelyek asszociátumokat képezve a nukleinsavakkal felismerik és kijavítják a genetikai hibákat. Rákos sejtek terápiája esetén viszont ezek a javító mechanizmusok a kívánt sejtpusztítás ellen dolgoznak. A projekt célja az alapvető DNS-hiba javító mechanizmus, a homológ rekombináció lépéseiben szerepet játszó nukleinsav-szerkezeteknek és nukleoprotein komplexeknek a centrális szerepet betöltő rekombináz, a humán Rad51 általi felismerését szabályozó kölcsönhatások szerkezeti és energetikai jellemzése. Az alkalmazandó modern és unikális biofizikai kísérleti technikák alkalmasak a speciális szerkezetekhez kötött fehérjék kötőhelyének mechanikai, szerkezeti, kinetikai és dinamikai tulajdonságainak jellemzésére és az egyes kötődési reakciók termodinamikai paramétereinek meghatározására. A vizsgálatokat a hidrosztatikai nyomás és a hőmérséklet függvényében végzett fluoreszcencia spektroszkópia, izotermikus titrációs kalorimetria, gyors kinetikai valamint egy-molekula érzékenységű fluoreszcencia mikroszkópiai, atomi erő mikroszkópiai és lézer-csipesz módszerek segítségével végezzük. A munkacsoport számára rendelkezésre álló modern módszerek egyedülállóan széles skálája lehetőséget ad az eredeti kísérleti megközelítésekre, és a résztvevő minősített kutatók gyakorlata garancia az új, izgalmas eredmények elérésére.
angol összefoglaló
The maintainance and stability of the genetic material of the cells is of vital significance. This task is fulfilled by the associates of specific proteins and DNA complexes that recognize and repair the DNA damages. In cancer cells, however, the very same mechanisms oppose the effect of chemo- or radation- therapy since these are aimed to destroy the genetic material. In this project we plan to study those structural conditions that are detrimental in one of the basic repair processes, homologous recombination in building up the functional nucleoprotein associates of human Rad51. This protein plays key role as a recombinase in human cells. We propose to implement unique experimental approaches of modern fluorescence spectroscopy, microscopy, calorimetry and single molecule studies that became recently available in the Department. These methods represent a unique combination of approaches that has not been applied in this field, and the participants are experts of these techniques. We suggest to structurally characterize the binding sites of the protein for self association, for association with regulating other proteins, primarily with HLTF, and with DNA segments, and determine the mechanical, dynamic, kinetic and crowding conditions of the macromolecular complex formation processes of vital significance.
Zárójelentés
kutatási eredmények (magyarul)
A projekt Kidolgozása során új biokémiai laboratóriumot hoztunk létre a homológ rekombinációban alapvető szerepet játszó humán Rad51 rekombináz előállítására és a fizikai mérések előkészítésére. A molekuláris klónozástól elindulva újraterveztünk és megvalósítottunk egy fehérje termeltetési és tisztítási eljárást, amellyel a hRad51 fehérje vad tipusát és négyféle triptofán-mutánsát spektroszkópiai tisztaságban és kb 50 M koncentrációban elő lehet állítani. Új mérőberendezést állítottunk össze és szoftvert fejlesztettünk az adatok kiértékeléséhez, amelynek segítségével a rekombináz funkcionális filamentumait felépítő monomérek határfelületi kötéserőssége meghatározható. Kimutattuk, hogy a DNS-hibajavításban kulcsfontosságú preszinaptikus filamentum szerkezete csak ATP-t kötve képes ellátni a funkcióját, és kimutattuk ennek a szerkezetnek a kiemelkedően erős stabilitását. Az általunk kidolgozott termeltetési és tisztítási eljárással előállított fehérje, a hRad51 alkalmas további fehérje önasszociációs és fehérje-DNS kötődési jelenségek tanulmányozására. Sikeres előkísérletek alapján elindítottunk két újabb kutatási irányt : A hRad51 triptofán mutánsai alkalmasak a funkcionális filamentum felépülési kinetikájának vizsgálatára; a dsDNS-re ép ülő filamentum szerkezete AFM-mérésekkel vizsgálható.
kutatási eredmények (angolul)
During the elaboration of the project, a new laboratory was established and equipped for the production and purification of the wt human recombinase, Rad51. We tackled the problems arising from the extremely strong tendency of this protein for association. We needed to implement and modify the described protocols starting from cloning and to reach spectroscopic purity and high concentration as ~ 50 M.
The procedure was elaborated for the wt protein and for four triptophan mutants. We constructed a new device and developed appropriate evaluation software by which the interface binding strength of protein oligomers can be determined. We applied this method for the functional presynaptic filament (PSF) of wt hRad51 built on ssDNA and for its other oligomer states. We determined the interface binding strength in various oligomer states and showed the detrimental role of ATP-binding in the functional structural form and in the stability of PSF. By having hRad51 samples available, we established the possibility for studying the conditions of protein self-association and DNA-binding reactions of outmost significance. We started two new lines of studies based on successful preliminary experiments. The kinetics of oligomerization can be studied by the signal of Trp-mutants (M.Kovacs, ELTE TTK), oligomerization on dsDNA could be successfully studied by using the AFM techniques available in the Institute (M.Z. Kellermayer).
Zotter A.; Olah J.; Hlavanda, E ; Bodor, A ; Perczel, A ; Szigeti, K ; Fidy, J ; Ovadi, J: Zn(2+)-Induced Rearrangement of the Disordered TPPP/p25 Affects Its Microtubule. Assembly and GTPase Activity, BIOCHEMISTRY Volume: 50 Issue: 44 Pages: 9568-9578, 2011
Fekete M.; Schay G.; Kardos J.; Pongor, Cs. , Kellermayer, M. S., Fidy, J: Effect of DNA binding on the self-association of the human recombinase protein Rad51, EUROPEAN BIOPHYSICS JOURNAL WITH BIOPHYSICS LETTERS Volume: 40 Supplement: 1 (2011) Pages: 138-138, 2011
Gusztáv Schay, Levente Herényi, Judit Fidy, and Szabolcs Osváth: Role of Domain Interactions in the Collective Motion of Phosphoglycerate Kinase, Biophysical Journal Vol. 104 677–682, 2013
Dániel Veres, Barnabás Bőcskei-Antal, István Voszka, Károly Módos, Gabriella Csík, András D. Kaposi, Judit Fidy, and Levente Herenyi: : Comparison of Binding Ability and Location of Two Mesoporphyrin Derivatives in Liposomes Explored with Conventional and Site-Selective Fluorescence Spectroscopy, J. PHYS.CHEM.B, 2012
Judit Oláh, Ágnes Zotter, Emma Hlavanda, Sándor Szunyogh, Ferenc Orosz, Krisztián Szigeti, Judit Fidy, Judit Ovádi: Microtubule assembly-derived by dimerization of TPPP/p25. Evaluation of thermodynamic parameters for multiple equilibrium system from ITC data, Biochimica et Biophysica Acta, General Subjects 1820 785–794, 2012
Melinda Fekete, Jozsef Kardos, Gusztav Schay, Judit Fidy: Structural stability of hsRad51 filaments of self-aggregates and of presynaptic complexes studied by electronmicroscopy and pressure tuning fluorescence spectroscopy., Biophysical Journal Vol.104, Issue 2, S1, p.422, 2013
Melinda Fekete, Jozsef Kardos, Gusztav Schay, Koppány Vass, Marta Wesolowska, Judit Fidy: Search for fluorescence techniques to monitor protein interactions in the presynaptic filament formation of homologous recombination, Proceedings of the Conference: Fluorescent Biomolecules and Their Building Blocks, Göteborg, Sweden, 5-8 jul 2012, 2012
Melinda Fekete, Jozsef Kardos, Gusztav Schay, Koppány Vass, Marta Wesolowska,, Judit Fidy: The conditions inducing the helical filament formation of the recombinase hsRad51 in solution and bound to ssDNA, Proceedings of the Conference: Prague Protein Spring Meeting 2012 May 3-6 Prague, 2012
Schay, G.; Borka, B.; Kernya, L.; Bulyáki, É.; Kardos, J.; Fekete, M.; Fidy, J.: Without Binding ATP, Human Rad51 does not Form Helical Filament on ssDNA, Journal of Physical Chemistry B, 2016
