Characterization of the function of Duox2-derived hydrogen peroxide in gallbladder epithelia  Page description

Help  Print 
Back »

 

Details of project

 
Identifier
103960
Type PD
Principal investigator Donkó, Ágnes
Title in Hungarian A Duox2 által termelt hidrogén-peroxid funkciójának vizsgálata epehólyag epithelben
Title in English Characterization of the function of Duox2-derived hydrogen peroxide in gallbladder epithelia
Keywords in Hungarian reaktív oxigén származékok, Duox, immunvédekezés, NADPH-oxidáz, hipotireózis, hidrogén-peroxid
Keywords in English Reactive oxygen species, Duox, host defense, NADPH oxidase, hypothyroidism, hydrogen peroxide
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)50 %
Biological basis of immunity related disorders (e.g. autoimmunity) (Council of Medical and Biological Sciences)40 %
Endocrinology (Council of Medical and Biological Sciences)10 %
Panel Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology
Department or equivalent Dept. of Physiology (Semmelweis University)
Starting date 2012-09-01
Closing date 2015-08-31
Funding (in million HUF) 15.360
FTE (full time equivalent) 2.70
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A sejtmembránban található Duox enzimek fő funkciója a hidrogén-peroxid termelés számos extracelluláris hem peroxidáz számára. Elsőként a pajzsmirigyben írták le, ahol a Duox2 nélkülözhetetlen a pajzsmirigyhormon szintézishez. Gerinctelenekben a Duox enzimek által termelt H2O2 egyik fontos funkciója az extracelluláris mátrix fehérjék ditirozin kötéseken keresztüli stabilizálása.
A Duox enzimek megtalálhatóak a légúti és gasztrointesztinális nyálkahártya felszíneken, ahol feltehetőleg fontos szerepük van a természetes immunitásban. A légutakban a laktoperoxidáz a Duox által termelt H2O2-ot hipotiocianát képzésére fordítja, mely egy hatékony antimikrobiális vegyület.
Munkacsoportunk nemrég kimutatta, hogy a húgyhólyag epithel sejtek is termelnek H2O2-ot Duox1-függő módon. In vivo cisztometria kísérletekben kimutattuk, hogy a termelt H2O2-nak a mechanikai jelátvitelben van szerepe, mivel Duox1-hiányos egerekben emelkedett a vizelési kontrakciók gyakorisága.
A pályázatban célom a Duox2 epehólyagban betöltött esetleges antimikrobiális, epithel sejt védő vagy jelátvitelt módosító szerepének vizsgálata.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Jelenlegi tudásunk alapján a Duox2 által termelt H2O2-nak több funkciója is lehet epehólyagban. Egy lehetséges funkcióként az immunvédekezésben betöltött szerepet szeretném vizsgálni, mivel az epehólyagban szalmonella fertőzés során gyakran található baktérium. A Duox2 által termelt H2O2 hozzájárulhat egy laktoperoxidáz alapú antimikrobiális védekező mechanizmushoz, ezért vizsgálni fogom a Duox-laktoperoxidáz interakció lehetőségét. A Duoxoknak azonban peroxidázoktól függetlenül is lehet szerepe az epehólyag sterilitásának fenntartásában, mivel kimutatták, hogy a H2O2-nak kemorepellens hatása van a baktériumokra.
Egy másik érdekes lehetőség, hogy a Duox által termelt H2O2 egy peroxidáz enzim által katalizált, ditirozin hidakkal stabilizált fehérje mátrix képzésre fordítódna, melynek epithel védő funkciója lehet az epe detergens tulajdonságával szemben. Ennek a megválaszolására vad típusú és Duox2 mutáns epehólyagban tervezem vizsgálni a ditirozin mennyiségét, valamint hogy a termelt H2O2-nak van-e sejtvédő funkciója az epesavas sókkal szemben.
Egy hasonlóan izgalmas másik lehetőség, hogy a Duox2 által termelt H2O2 a jelátviteli útvonalakat befolyásolja, mivel a H2O2 a szomszédos sejtekhez diffundálva, parakrin mediátorként módosíthat jelátviteli útvonalakat. Egyre több adat utal arra, hogy a Duox által termelt reaktív oxigén származékok fokozzák a kalcium beáramlást, ami lokálisan a kalcium és H2O2 szignál felerősödéshez vezet. Annak megválaszolására, hogy hasonló pozitív visszacsatolási mechanizmus létezik-e epehólyagban, a kalcium szignál összehasonlítását tervezem vad típusú és Duox2 mutáns epehólyag epithel sejtekben.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Napjainkban egyre inkább elfogadott, hogy a reaktív oxigén származékok, mint például a hidrogén-peroxid, a szuperoxid vagy ezek reakciótermékei különféle fiziológiás folyamatokban játszanak szerepet, mint például az immunvédekezés, hormonképzés, jelátvitel, sejtosztódás, apoptózis vagy szaporodás. Emellett az is ismert, hogy fontos szerepük van az öregedésben, a tumorképződésben, vagy a neurodegeneratív és gyulladásos betegségek kialakulásában.
Az epehólyag nem tekinthető egy passzív tároló szervnek, mivel számos fiziológiás funkciója van, úgy mint a víz vagy elektrolitok felszívása és kiválasztása, vagyis az epe besűrítése és tartalmának szabályozása. Az epithel sejtek által termelt nyálkarétegnek sejtvédő funkciót tulajdonítanak az epehólyagban. Munkacsoportunk érdekes megfigyelése, hogy az epehólyag epithel sejtjei Duox2-függő módon H2O2 termelésre képesek, új szemszögbe helyezi e szerv fiziológiás funkcióját. Függetlenül attól, hogy az epithel sejtek által termelt H2O2-nak az antimikrobiális védekezésben, az extracelluláris mátrix módosításban vagy a jelátvitelben van szerepe, bármilyen új megfigyelés az epehólyag epithel redox-homeosztázisára vonatkozólag, olyan betegségek kialakulásnak a pontosabb megértéséhez vezethet, mint az epekő képződés, a krónikus epehólyag gyulladás vagy az epehólyag daganatos megbetegedései.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A Duox enzimeket (Duox1 és Duox2) elsőként a pajzsmirigyben írták le, ahol a Duox2 által termelt hidrogén-peroxid (H2O2) nélkülözhetetlen a tireoperoxidáz által katalizált pajzsmirigyhormonok szintéziséhez. A Duox enzimek a légúti és gasztrointesztinális epitél nyálkahártya felszínein feltehetően az immunvédekezésben vesznek részt. Alacsonyabb rendű élőlényekben, mint például a tengerisün vagy a Caenorhabditis elegans hengeresféreg, a Duox enzimek elsődleges funkciója az extracelluláris mátrix (ECM) fehérjék ditirozin kötéseken keresztüli stabilizálása. Munkacsoportunk nemrég leírta, hogy egér húgyhólyagban a Duox1 által termelt H2O2 részt vesz az urotélium mechanikai jelátvitelében. Habár gerinctelenekben számos genetikailag alátámasztott kísérlet támogatja az itt leírt Duox funkciókat, a Duox2 enzim emlős szervezetben betöltött fiziológiás szerepének az alátámasztása még további kísérleteket igényel.
A Duox2-génhiányos egerek bevonásával fő célom a Duox2 immunvédekezésben, ECM fehérjék stabilizálásában és jelátvitelben betöltött szerepének vizsgálata egy eddig még nem vizsgált expressziós helyen, az epehólyagban.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Duox enzymes are dedicated plasma membrane hydrogen peroxide generators that support several extracellular hemoperoxidases. They were first described in the thyroid gland, where Duox2 is crucial in thyroid hormone biosynthesis. In invertebrates an important function of Duox enzymes is to produce H2O2 for the oxidative crosslinking of extracellular matrix proteins through dityrosine bridges.
Duox enzymes are also expressed on different mucosal surfaces like gastrointestinal and airway epithelia where they probably have an important role in innate immune defense. In the respiratory tract epithelium Duox-produced H2O2 is utilized by lactoperoxidase to oxidize thiocyanate into hypothiocyanate, which is an effective antimicrobial compound.
We have recently shown that primary mouse urinary bladder epithelial cells produce H2O2 in a Duox1-dependent manner. Using in vivo cystometry we could show that Duox1-produced H2O2 is involved in mechanotransduction of the urinary bladder since the frequency of voiding contractions was higher in Duox1 knockout animals.
In this project my goal is to explore the potential antimicrobial, epithelial cell protecting or signal transduction modulator effect of Duox2-derived H2O2 in gallbladder using wild-type and Duox2 mutant mice.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

According to our present state of knowledge Duox2-produced H2O2 may serve multiple roles in gallbladder epithelia. As one possibility I plan to investigate the potential host defense role since gallbladder is often colonized by Salmonella upon typhoid fever. Duox2-derived H2O2 may support lactoperoxidase-mediated antimicrobial defense mechanism therefore I will explore the potential Duox-lactoperoxidase interaction in gallbladder epithelia. However, independently of an extracellular peroxidase expression, Duox2 may have a role in maintaining the sterility of gallbladder mucosa because it was shown that H2O2 has a chemorepellent effect on bacteria.
Another exciting option is that Duox2-derived H2O2 is utilized by an extracellular peroxidase to form a dityrosine-crosslinked protein barrier protecting gallbladder epithelia against the detergent effect of bile. To answer this question I will compare the dityrosine content of wild type and Duox2 mutant mouse gallbladder and study if epithelial production of H2O2 offers any protection against bile salts.
A distinct but equally exciting possibility is that Duox2-produced H2O2 may affect signaling processes, since H2O2 can diffuse to neighboring cells, act in a paracrine manner and hereby may influence signal transduction in gallbladder. A growing body of evidence suggests that Duox-derived ROS activates calcium influx leading to local amplification of calcium as well as ROS signal. To explore whether a similar positive feedback loop exists in gallbladder epithelia I will examine the calcium signal in wild type and Duox2-deficient gallbladder epithelial cells.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

It is increasingly being recognized that reactive oxygen species (ROS), such as superoxide, hydrogen peroxide and their reaction products have a role in various physiological processes including host defense, hormone biosynthesis, signal transduction, mitogenesis, apoptosis, and fertilization. On the other hand besides their physiological functions they are also thought to be responsible for senescence, tumors, neurodegenerative or inflammatory diseases.
The gallbladder is not a passive storage compartment but it performs many physiological functions, including absorption and secretion of water and electrolytes, control of the content and concentration of bile. The mucus secreted by gallbladder epithelial cells is thought to be a barrier protecting the mucosa. Our interesting observation that epithelial cells of the gallbladder produce H2O2 in a Duox2-dependent way opens new insight into the physiology of this organ. Whether H2O2 has a role in antimicrobial defense, in extracellular matrix modification or in signal transduction; any new observation in the redox-physiology of gallbladder epithelia would lead to a better understanding of the development of gallbladder diseases like cholelithiasis/gallstone formation, chronic inflammation or gallbladder cancer.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Duox enzymes (Duox1 and Duox2) were first described in the thyroid gland where Duox2-produced hydrogen peroxide (H2O2) is essential for thyroid hormone biosynthesis. In lower animal species like sea urchin or the nematode Caenorhabditis elegans, the primary function of Duox enzymes seem to be the stabilization of extracellular matrix (ECM) proteins through dityrosine bridges. At mucosal surfaces of the respiratory and gastrointestinal epithelia a host defense role was suggested for Duoxes. Recently we reported that Duox1-produced H2O2 in mouse urinary bladder contributes to mechanotransduction of the urothelium. Although there are several genetic evidences supporting the described roles of Duox in invertebrates, the confirmation of the physiologically relevant in vivo function of Duox2 in mammals requires further experimental proof.
In this project my primary purpose is to examine the role of Duox2-produced H2O2 in host defense, in ECM stabilization or in signal transduction at a new, so far uncharacterized expression site, the gallbladder.





 

Final report

 
Results in Hungarian
Bár alacsonyabb rendű élőlényekben számos genetikailag alátámasztott példa írja le a Duox enzimek szerepét, emlősökben betöltött fiziológiás funkciójának azonosításához még további kísérletek szükségesek. Mostanáig mindössze egy egér törzset írtak le, amivel lehetőség nyílik a Duox2 funkciójának in vivo vizsgálatára. Az egerek súlyos hipotireózisban szenvednek, mivel egy egynukleotidos mutációt hordoznak a Duox2 16. exonjában, ami egy konzervált valint (674) glicinre módosít. A mutáns enzimet heterológ expressziós rendszerben kifejezve vizsgáltuk, mi áll a Duox2 funkcióvesztésének hátterében. Kísérleteinkben kimutattuk, hogy a V674G mutációt hordozó Duox2 enzim nem termel H2O2-ot és nem jut el a plazmamembránba, hanem az endoplazmás retikulumban maradva továbbra is komplexet képez érési faktorával, a Duoxa2-vel. Eredményeinket egér nyálmirigy metszetek immunhisztológiai vizsgálatával támasztottuk alá. A mutáns Duox2 kevésbé volt detektálható az apikális plazmamembránban, helyette pontszerű intracellulárisan struktúrákat alkotott. Egy másik tanulmányunkban a Duox1 által termelt reaktív oxigén vegyületek jelátvitelben betöltött szerepét vizsgáltuk különféle epidermális sejtvonalakban. Eredményeink szerint az epidermális növekedési faktor kalcium jelen keresztül aktiválja a Duox1 enzimet, amely egy újfajta jelátviteli útvonal, melyben az intracelluláris kalcium koncentráció változás a Duox1 enzim aktivációján keresztül redox jellé alakul át.
Results in English
Although in lower animal species there are several genetic evidences describing the role of Duox enzymes, the confirmation of the physiologically relevant in vivo function in mammals require further experiments. To date there is only one solely Duox2 deficient mice that enables in vivo examination of the enzyme function. This mice suffer from severe hypothyroidism; and they carry a single nucleotide mutation in exon 16 that results in a highly conserved valine (674.) to glycine amino acid exchange. To clarify how the V674G mutation leads to the loss of Duox2 function we analyzed it in heterologous expression system. Our results show that the V674G mutant Duox2 failed to release extracellular H2O2, does not localize to the plasma membrane, but retains in the endoplasmic reticulum, where it still forms a stable complex with its maturation factor Duoxa2. Performing immunohistochemistry on mouse salivary gland sections we confirmed our cell culture studies, because the mutant Duox2 was less intense along the apical plasma membrane and formed dot-like vesicular structures within intracellular sites. In another study we addressed the Duox1 produced ROS as a signaling molecule in different epidermal cell lines and we demonstrate that epidermal growth factor stimulation activates H2O2 production of Duox1 through calcium ions, which provide evidence for a new paradigm in which changes of intracellular calcium concentration are transformed into redox signals through Duox1.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=103960
Decision
Yes





 

List of publications

 
Ágnes Donkó, Stanislas Morand, Agnieszka Korzeniowska, Howard E. Boudreau, Melinda Zana, László Hunyady, Miklós Geiszt, Thomas L. Leto: Hypothyroidism-associated missense mutation impairs NADPH oxidase activity and intracellular trafficking of Duox2, Pubmed, 2014




Back »