Genetic and functional analyses of viruses of intensively reared fishes  Page description

Help  Print 
Back »

 

Details of project

 
Identifier
104315
Type PD
Principal investigator Doszpoly, Andor
Title in Hungarian Intenzív tenyésztésbe vont halfajok vírusainak genetikai és funkcionális vizsgálata
Title in English Genetic and functional analyses of viruses of intensively reared fishes
Keywords in Hungarian vírus izolálás, herpeszvírus, iridovírus, hal, vírus-genom, PCR, génexpresszió
Keywords in English virus isolation, herpesvirus, iridovirus, fish, viral genome, gene expression
Discipline
Veterinary sciences (Council of Complex Environmental Sciences)100 %
Ortelius classification: Viral pathogens of animals
Panel Plant and animal breeding
Department or equivalent Institute for Veterinary Medical Research (Centre for Agricultural Research, Hungarian Academy of Sciences)
Starting date 2013-02-01
Closing date 2017-01-31
Funding (in million HUF) 11.235
FTE (full time equivalent) 3.20
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Ph.D. munkám során egy hal-adenovírus és több hal-herpeszvírus (alloherpeszvírusok) genetikai elemzését végeztem el. Eredményeim jelentősen hozzájárultak az alloherpeszvírusok rendszertanának gyökeres megváltoztatásához. E vírusok és néhány további, állategészségügyi problémákat okozó hal-vírus átfogó vizsgálatát tervezem mind klasszikus, mind pedig molekuláris módszerekkel. A vizsgálatok tárgyát képező alloherpeszvírusok állategészségügyi szempontból fontosak, jelentős károkat okoznak világszerte, ami további vizsgálatuk szükségességét indokolja. Mind a hal-adenovírus, mind az alloherpeszvírusok genomja meglehetősen nagy, és számos, ismeretlen funkciójú gént tartalmaznak. Ezeknek a feltételezett géneknek tervezem a további vizsgálatát, annak megállapításához, hogy kifejeződnek-e, és ha igen, akkor a virus replikáció melyik fázisában. Az érdekesebbnek tűnő gének közül néhányat tovább vizsgálnék, in vitro expressziós rendszerben. A virális fehérjék apoptózist előidéző vagy gátló hatását sejttenyészeteken vizsgálnám. Egyes, feltételezhetően enzimatikus funkcióval bíró virális fehérjék vizsgálatát is tervezem.
Tervezem továbbá a hazai intenzív halgazdaságokban felbukkanó, újabb vírusok izolálását, és ezek, valamint a külföldi együttműködőink által küldött további vírusok genetikai vizsgálatát. Az új, érdekesnek bizonyuló vírusok részletes genetikai elemzésére is sor kerülne, a vírusok genomjának részleges, vagy amennyiben lehetőség van rá, teljes nukleotid sorrendjének meghatározásával. A kapott eredményeket bioinformatikai módszerekkel elemezném, és filogenetikai számításokat végeznék, mely által a vírusok rokonsági viszonyaira következtethetnénk.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Alapvetően két fő kérdésre szeretnék válaszolni a tervezett kutatómunka során. Az első, az eddig általunk tanulmányozott hal-vírusok génjeinek illetve géntermékeinek kifejeződésére, funkciójára keresi a választ. A másik, az intenzív tenyésztésbe vont halfajok ismeretlen (feltehetően virális) kórokozó által okozott betegségeinek vizsgálata. A betegség hátterében álló vírusok izolálása, azonosítása.
A hal-adenovírus és az alloherpeszvírusok nagy genommal rendelkeznek, melyek sok feltételezett gént tartalmaznak. Ezen gének nagy része ismeretlen funkciójú, általában homológia keresés alapján sem lehet jósolni betöltött szerepükre. Szeretném megállapítani ezen génekről, hogy transzkripciójuk megtörténik-e, és ha igen, akkor a vírus replikáció mely szakaszában. Néhány érdekesebb gén további vizsgálatát tervezem, mely során a géntermékek sejtekre gyakorolt hatását vizsgálnám. Egyes géntermékek a homológia keresések alapján feltételezhetően enzimatikus funkciójú doméneket tartalmaznak, ezeknél szeretnem megvizsgálni, hogy valóban rendelkeznek-e ilyen szereppel. A kapott adatok segítségével jobban megértenénk ezen kevéssé tanulmányozott vírusok működését.
Intenzív halgazdálkodás során fellépő elhullások, betegségek kórokozói sok esetben nem ismeretesek. Sok új kórokozót azonosítanak, ahogy újabb fajokat vonnak intenzív tenyésztésbe. Tervezem az ismeretlen hátterű betegségek vizsgálatát, a kórokozó vírus izolálását és/vagy genetikai örökítőanyagának kimutatását, a meghatározott részleges vagy teljes genom alapján azok taxonómiai besorolását. Ezekkel a vizsgálatokkal a hazai haltenyésztésben előforduló vírusok diverzitására és prevalenciájára vonatkozóan nyernénk adatokat.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

Eltekintve a bejelentési kötelezettség alá tartozó betegségek kórokozóinak diagnosztikai kimutatásától, hazánkban viszonylag kevesen foglalkoznak a halak vírusos betegségeivel. Témacsoportunk nemrégiben a hal-adenovírus és hal-herpeszvírusok filogenetikai és rendszertani elemzését kezdte el, és PhD munkám során ezekbe a kutatásokba kapcsolódtam be. A jelen pályázati terv keretében alapvetően e vizsgálatokat kívánom folytatni, illetve kiterjeszteni további, halakban előforduló víruscsaládok képviselőire. A hasonló területen tevékenykedő, külföldi laboratóriumokból formális vagy informális együttműködési kapcsolatot létesítettünk már többek között amerikai, francia, holland, német, olasz és orosz kutatókkal, akik a jövőben is szívesen átadnak számunkra érdekes vagy különleges vírus-izolátumokat. Pályázatom támogatása biztosítaná, hogy a halvirológiai kutatások intenzitása és színvonala hazánkban is növekedhessen. Kezdetben a hal-adenovírus és hal-herpeszvírusok már megkezdett vizsgálatát folytatnám. További víruscsaládok tagjainak hazai előfordulását PCR-es szűrővizsgálatokkal próbálnám felmérni. A teljes genom-szekvenciák alapján további tanulmányozásra érdemes géneket választanék ki, és ezek kifejeződését és biológiai szerepét vizsgálnám. A fehér tok adenovírusa máig is az egyetlen halból származó adenovírus. Korábban megállapítottuk, hogy az Adenoviridae család eddig ismert tagjaitól mind méretében, mind szerveződésében jelentősen eltérő genommal rendelkezik, és több tucat olyan ORF-et tartalmaz, amelyek feltételezett fehérje terméke az adatbázisokban található fehérjék közül eggyel sem mutat homológiát. Azonosítottunk továbbá néhány, enzimatikus funkciójú fehérjék génjével homológ ORF-et is, melyek funkcionális vizsgálata világviszonylatban is új adatokat szolgáltatna. A hal-herpeszvírusokat a legújabb rendszertan szerint a Herpesvirales renden belül az Alloherpesviridae család tartalmazza. Néhány alloherpeszvírus behatóbb vizsgálatát is tervezem, különös tekintettel az általuk okozott betegség elleni védekezésre illetve a fertőzés megelőzésre szolgáló vakcinák előállítása szempontjából jelentőséggel bíró szerkezeti (kapszid, membrán és tegument) fehérjékre.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A hal mint fehérjeforrás egyre fontosabb szerephez jut világszerte. Rendszeres fogyasztása jó hatással van az emberi szervezetre. A szükségleteket viszont már régóta nem képes biztosítani a természetes állomány, ezért egyre több fajt vonnak intenzív tenyésztésbe. Az ilyen, intenzív tenyészetekben kitörő járványok komoly gazdasági károkat okoznak. Hazánkba az utóbbi időben más földrészről származó, újabb halfajokat is tenyésztésbe vettek, ami potenciálisan új kórokozok megjelenését okozhatja.
Eddigi munkám során halak vírusainak molekuláris tanulmányozásában szereztem tapasztalatot. A pályázat támogatásával a kutatásaim folytatását és kiterjesztését tervezem. Új, eddig ismeretlen vírusok felfedezése, jellemzése és ezek publikálása várható, olyan esetekből, melyek gazdasági károkat okoznak halgazdaságokban. Az új vírusok jobb megismerése érdekében azok genetikai állományát vizsgálnám, mely alapján a kórokozó vírus rendszertani helye megállapítható. A vizsgálatok által a hazai intenzív tenyésztésbe vont hal-állományok vírusos fertőzöttségének mértékéről is átfogó képet kapnánk.
A vizsgálatok során nyert adatok hozzájárulhatnak modern vírus-kimutatási módszerek kifejlesztéséhez, melyek lehetővé tennék a betegséget okozó kórokozók gyors felismerését. A szekvencia adatok alapján a jövőben lehetséges lesz a legmodernebb, úgynevezett DNS-vakcinák kifejlesztése. A vírusok biológiájának jobb megértése elősegítheti az ellenük hátasos vírusellenes szerek kiválasztását.
A hal-adenovírus jobb megismerése a jövőben vakcina-vektorkent való használatát tenné lehetővé. Elképzelhető, hogy a humán daganat-terápiában alkalmazható virális géneket is azonosíthatunk a kutatómunka során.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

In my PhD study, I have carried out the genetic analysis of a fish adenovirus and several fish herpesviruses from the newly established family Alloherpesviridae. These results assisted to significant changes in the taxonomy of fish herpesviruses. I intend to study these and other important fish viruses by classical and molecular methods. The alloherpesviruses are important veterinary pathogens causing severe economical losses worldwide. The genome size of the fish adenovirus and the alloherpesviruses is large, and contains a large number of ORFs with unknown function. I would like to study the process and time course of the transcription and expression of these putative genes during the replication cycle of the viruses. Some genes would be examined in in vitro expression systems, too. The apoptosis inhibition or induction effect of the viral proteins will be examined on different cell lines. Investigation of the assumed enzymatic function of certain viral proteins is also planned. We hope to better understand the replication mechanisms of these poorly studied viruses. I also intend to attempt the isolation and primary genetic characterization of several other viruses, originating from intensively reared fish species, or sent by foreign collaborators. The further genetic analysis of the novel, interesting viruses would be carried out, including the sequencing of their genome partially or completely, if possible. The sequences will be analyzed by bioinformatics methods and phylogenetic calculations will be carried out to determine the taxonomical position of these viruses. Finally, the possibility of the elaboration of specific preventive methods will also be checked.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

The first aim is to study the transcription, expression and function of the putative genes of the fish adenovirus and herpesviruses sequenced in our laboratory previously. A second goal is to find and isolate new viral pathogens from yet unknown fish diseases. The viruses will be genetically characterized for taxonomical, diagnostic and preventive purposes.
The large genome of fish adeno- and herpesviruses contain many hypothetical genes of unknown function in lack of homology to other proteins. I plan to study if these genes are transcribed at all and if yes, at which stage of the viral replication. Selected genes would be examined further including to test the effects of their products on the cells. By homology search, the proteins coded by a couple of ORFs seemed to contain conservative domains of enzymatic function. I would examine whether these proteins have the predicted function indeed or not. The results would help better understand the replication strategy of these viruses.
The causative agent of mortalities and diseases of intensively reared fishes is often unknown. As the number of fish species involved in farming grows, many new pathogenic agents are identified. I plan to study fish diseases caused by unknown viruses. I will attempt the isolation and/or the amplification of genome parts of such viruses. Based on partial or complete genome sequences, proposal for the classification of new viruses can be made. The successful completion of the research would provide data about the diversity and prevalence of different fish viruses in Hungarian fish hatcheries.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Apart from the diagnostics of OIE listed diseases, very few scientists work on viral diseases of fish in Hungary. Our study group has recently started the phylogenetic and taxonomical analyses of a fish adenovirus and some fish herpesviruses. I have joined these researches during my graduate years and also for my PhD study. I plan to continue these investigations and extend them to other fish viruses, too. We have established formal or informal collaboration with several scientists from foreign (American, French, Dutch, German, Italian and Russian) laboratories working on similar field. They would also provide us novel or interesting viruses for molecular analyses. The present grant if supported would help increase the intensity and level of fish virology research in Hungary. Initially, I would continue the study of the fish adenovirus and the fish herpesviruses. I plan to assess the prevalence of viruses from some other virus families in Hungary by PCR screening. Based on the full genome sequences, I will select certain genes for more profound studies aiming at the examination of their expression and biological function. The white sturgeon adenovirus is still the only known fish adenovirus. We have demonstrated that it has a large genome of unique organization with a large number of ORFs without homology to any known genes. We have identified some ORFs, whose predicted products seem to show homology to proteins with enzymatic function. Such investigations would provide internationally significant, new scientific results. According to the new taxonomy, the family Alloherpesviridae within the order Herpesvirales contains the fish herpesviruses. I plan to carry out a deeper examination of some alloherpesviruses with special regard to their structural (capsid, membrane and tegument) proteins that might be important in the development of vaccines for specific prevention of certain fish diseases.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

The fish as a protein source for humans is increasingly important throughout the world. Regular consumption of fish meat has an advantageous effect on the human health. The natural fish populations are no longer able to supply the needs, therefore, more and more fish species become involved in intensive breeding. In such fish hatcheries, infectious diseases can cause serious economic losses. In the Hungarian fish breeding several foreign fish species have appeared recently. Potentially, this could result in the emergence of new pathogens. During my PhD research, I have gained experience in molecular study of different fish viruses. I would like to continue and extend these investigations with the support of the present OTKA grant. Discovery, characterization and publication of novel, previously unknown viruses from cases causing economic losses to domestic (or foreign) fish hatcheries are also expected. The genetic content of the newly detected viruses will be studied, and based on these results modern viral diagnostic methods, facilitating the quick identification of different pathogenic agents, will be developed. We plan to get an overall picture about the diversity and prevalence of different viruses in the Hungarian fish farms. In a later stage of the project, the elaboration of specific preventive methods including DNA-vaccines will be attempted. A better understanding of the biology of these viruses could help in the selection of antiviral drugs. In the future, the fish adenovirus might be engineered into a vaccine vector. During the study, the identification of certain viral genes that might be useful in human gene therapy would also be possible.





 

Final report

 
Results in Hungarian
Munkám fő irányvonala, természetes vizekben illetve az intenzív halgazdálkodásokban fellépő virális eredetű betegségek kórokozóinak megismerése, izolálásuk és/vagy genetikai örökítőanyaguk kimutatása, majd azok taxonómiai besorolása volt. Mely során sikerült több eddig ismeretlen alloherpesz-, cirko- és aquabirnavírust (CyHV-4, SbSHV-2, SalHV-4, EeCV-1, EeCV-2 és TABV) azonosítanunk/izolálnunk illetve genetikai állományukat részben vagy egészben megfejtenünk. Elsőként sikerült adatokat nyernünk egy hal-cirkovírus szerv-specifitásáról illetve a vírus prevalenciájáról. A Magyarországon cirkuláló ranavírus törzsek pontos azonosítása illetve járványtani nyomkövetése céljából két izolátum teljes genom szekvenciájának meghatározását és analízisét végeztük el. Egyéb vizsgálataink során sikerült bebizonyítani, hogy a lazacfélék és tokfélék kromoszómái tartalmaznak ősi herpeszvírus eredetű szekvenciákat, melyek gondokat okozhatnak a PCR-en alapuló diagnosztikai vizsgálatoknál. Pályázatom másik irányvonala, a már izolált hal vírusok transzkripciójának, génexpressziójának és géntermékeinek vizsgálata volt. Az Ictalurid herpesvirus 2-nek a génexpressziós mintázatának meghatározásába kezdtünk bele. Míg a tokhal adenovírusa által kódolt enzim és strukturális fehérjék enzimkinetikai illetve térszerkezeti vizsgálatait próbáltuk elvégezni. A lénai tok állományokat tizedelő alloherpeszvírus ellen DNS-vakcina fejlesztésbe fogtunk.
Results in English
Basically, there were two main questions in the grant proposal. First is the study of unknown diseases (with viral origin) occurring in fish hatcheries, the isolation, the identification and the taxonomical classification of the causative agents. We successfully isolated or identified several novel alloherpes-, circo- and aquabirnaviruses (CyHV-4, SbSHV-2, SalHV-4, EeCV-1, EeCV-2 and TABV) and sequenced their genome partially or completely. Firstly we gained data about the organ tropism and prevalence of a fish circovirus. Two Hungarian ranavirus strains were completely sequenced for accurate identification and epidemiological tracking. We also found evidence of herpesvirus integration in the chromosomes of salmon and sturgeon species, causing false positive results during diagnostic PCRs. The second part of the grant proposal was the study of the transcription and function the genes and gene products of fish viruses. The determination of the gene expression profile of the Ictalurid herpesvirus 2 has been started. Enzymatic and christallographic studies of proteins encoded by the genome of the sturgeon adenovirus have been also commenced. We developed some DNA-vaccine candidates against Siberian sturgeon alloherpesvirus, as well.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=104315
Decision
Yes





 

List of publications

 
Doszpoly A, Karaseva TA, Waltzek TB, Kalabekov IM, Shchelkunov IS: Atlantic salmon papillomatosis in Russia and molecular characterization of the associated herpesvirus, Dis Aquat Org 107(2):121-127, 2013
Doszpoly A, Tarján ZL, Glávits R, Müller T, Benkő M: Full genome sequence of a novel circo-like virus detected in an adult European eel Anguilla anguilla showing signs of cauliflower disease, Dis Aquat Org DOI:10.3354/dao02730, 2014
Doszpoly A, Papp M, Deákné PP, Glávits R, Ursu K, Dán Á: Molecular detection of a putatively novel cyprinid herpesvirus in Sichel (Pelecus cultratus) during a mass mortality event in Hungary, Archives of Virology, 2015
Doszpoly A, Tarján ZL, Glávits R, Müller T, Benkő M: Full genome sequence of a novel circo-like virus detected in an adult European eel Anguilla anguilla showing signs of cauliflower disease, Dis Aquat Org 109: 107-115, 2014
Doszpoly A, Papp M, Deákné PP, Glávits R, Ursu K, Dán Á: Molecular detection of a putatively novel cyprinid herpesvirus in Sichel (Pelecus cultratus) during a mass mortality event in Hungary, Archives of Virology 160(5): 1279-1283, 2015
Feher E, Doszpoly A, Horvath B, Marton S, Forro B, Farkas SL, Banyai K, Juhasz T: Whole genome sequencing and phylogenetic characterization of brown bullhead (Ameiurus nebulosus) origin ranavirus strains from independent disease outbreaks, Infect Genet Evol 45: 402-407, 2016
Doszpoly A, Kalabekov IM, Breyta R, Shchelkunov IS: Isolation and characterization of an atypical Siberian sturgeon herpesvirus strain in Russia: novel North American Acipenserid herpesvirus 2 strain in Europe?, J Fish Dis doi:10.1111/jfd.12611, 2017
Hanson L, Doszpoly A, van Beurden SJ, de Oliveira Viadanna PH, Waltzek T: Alloherpesviruses of Fish. In: Aquaculture Virology., Academic Press, pp. 1-32. ISBN 9780128015735, 2016
Doszpoly A, Karaseva TA, Waltzek TB, Shchelkunov IS: Partial molecular characterization of the Atlantic salmon papillomatosis virus, 16th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, September 2-6, p165, Tampere, Finland, 2013
Doszpoly A, Shchelkunov IS, Waltzek TB: Molecular comparision of sturgeon alloherpesviruses, XIVth IUMS, July 27-August 01, p643, Montreal, Canada, 2014
Borzák R, Sellyei B, Székely C, Doszpoly A: Molecular detection and genome analysis of circoviruses of European eel (Anguilla anguilla) from Lake Balaton, Magyar Mikrobiológiai Társaság 2014. évi Nagygyűlése, October 15-17, Keszthely, Hungary, 2014
Doszpoly A, Tarján Z, Glávits R, Müller T, Benkő M: Cirkovírus kimutatása karfiolbetegség tüneteit mutató angolnából, XXXVIII. Halászati Tudományos Tanácskozás, May 28-29, Szarvas, Hungary, 2014
Borzák R, Sellyei B, Székely C, Doszpoly A: Molecular detection and genome analysis of circoviruses of European eel (Anguilla anguilla) and Sichel (Pelecus cultratus) from lake Balaton, Hungary, 17th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, September 07-11, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 2015
Borzák R, Sellyei B, Székely C, Doszpoly A: Balatoni angolnákból (Anguilla anguilla) és gardából (Pelecus cultratus) kimutatott circovírusok molekuláris elemzése, XXXIX. Halászati Tudományos Tanácskozás, May 20-21, Szarvas, Hungary, 2015
Farkas S, Doszpoly A, Borzák R, Bányai K, Juhász T: Whole genome sequencing of two Hungarian Ranavirus strains isolated from brown bullhead (Ameiurus nebulosus), 17th EAFP International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, September 07-10, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 2015
Farkas S, Doszpoly A, Borzák R, Bányai K, Juhász T: Magyarországi ranavírus izolátumok genetikai diverzitásának vizsgálata, XXXIX. Halászati Tudományos Tanácskozás, May 20-21, Szarvas, Hungary, 2015
Doszpoly A, Papp M, Deákné PP, Glávits R, Ursu K, Dán Á: Molecular detection of a putatively novel cyprinid herpesvirus in sichel (Pelecus cultratus) during a mass mortality event in Hungary, 17th EAFP International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, September 07-10, Las Palmas de Gran Canaria, Spain, 2015




Back »