Activation of Strong Covalent Bonds in Metalloenzymes: Theoretical Studies  Page description

Help  Print 
Back »

 

Details of project

 
Identifier
108955
Type PD
Principal investigator Rokob, Tibor András
Title in Hungarian Erős kovalens kötések aktiválása metalloenzimekben: elméleti tanulmányok
Title in English Activation of Strong Covalent Bonds in Metalloenzymes: Theoretical Studies
Keywords in Hungarian reakciómechanizmus, enzim, átmenetifém, kvantumkémia, kötésaktiválás, epoxidálás, nitrocsoport, dioxigén, dihidrogén
Keywords in English reaction mechanism, enzyme, transition metal, quantum chemistry, bond activation, epoxidation, nitro group, dioxygene, dihydrogene
Discipline
Physical Chemistry and Theoretical Chemistry (Council of Physical Sciences)100 %
Ortelius classification: Quantum chemistry
Panel Chemistry 1
Department or equivalent Institute of Organic Chemistry (Research Center of Natural Sciences, Hungarian Academy of Sciences)
Starting date 2013-09-01
Closing date 2016-09-30
Funding (in million HUF) 21.886
FTE (full time equivalent) 2.47
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

A Természet általában fémtartalmú proteineket használ „nehéz” reakciókban, így például a dioxigén, dihidrogén, C–C és C–H kötések, vagy aromás gyűrűk aktiválásához. A szerepet játszó intermedierek sokszor nagyon reaktívak, nehezítve ezzel a kísérleti jellemzést. Az elméleti számítások nagyban hozzájárulhatnak a mechanisztikus tanulmányokhoz azáltal, hogy atomi szintű leírást adnak az azonosítható intermedierekről, és az azokat összekötő reakcióutakról. Jelen projekt célja metalloenzimekben zajló kötésaktiválási reakciók megértése klasztermodelleken vagy teljes enzimeken végzett kvantummechanikai, illetve kombinált kvantummechanikai–molekulamechanikai számítások segítségével. Fő törekvésem eddig feltáratlan reakcióutak leírása O2 és H2 aktiválásában és hasznosításában részt vevő monovas és divas enzimek esetében. A vizsgálandó konkrét folyamatok közé tartozik az O2 aktiválás epoxidálás céljára a benzoil-CoA epoxidáz (BoxAB) és a fenilacetil-CoA epoxidáz (PaaABCE) nem-hem divas enzimekben, illetve nitrovegyületté történő N-oxidálás céljára egy p-aminobenzoesav oxigenázban (AurF). Részletesen fogom vizsgálni a PaaABCE és az AurF különleges reaktivitását, így az oxigénezés reverzibilitását és a szokatlan szubsztrátoxidálási sztöchiometriát. Tanulmányozni kívánom továbbá a monovas-hidrogenázt, leírást adni arról, hogyan osztja meg a H2 aktiválás feladatát az enzimkörnyezetben a vascentrum és a Lewis-savas kofaktor.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Erős kovalens kötések aktiválásához, például az O2, H2, alifás vagy aromás szénhidrogének kötéseinek hasításához, a Természet gyakran metalloenzimeket alkalmaz. A koordinációs szféra, vagy akár a távolabbi aminosavak finomhangolásának köszönhetően a proteinen belül igen reaktív intermedierek képződhetnek, melyek azonban szelektíven az átalakítandó molekulát támadják ártalmas mellékreakciók veszélye nélkül. A jelen projekt keretében kvantummechanikai vagy kombinált kvantummechanikai–molekulamechanikai számításokat tervezek annak érdekében, hogy O2-t aktiváló és szubsztrátokat oxidáló, illetve H2-t aktiváló metalloenzimek kísérletileg megfigyelhető és nem megfigyelhető intermediereiről atomi szintű leírást adjak, és feltárjam a reakcióutakat. A tanulmányozásra kiválaszott enzimek a BoxAB, PaaABCE, AurF és a [Fe]-hidrogenáz. Többek között az alábbi kérdésekre keresem a választ: Milyen szerkezetű az aktív oxigéntartalmú speciesz? Milyen faktoroknak köszönhető, hogy a fém és dioxigén kölcsönhatása pont ezt a specieszt eredményezi? A speciesz mely tulajdonságai teszik lehetővé a természetes szubsztráttal való reakciót, és hogyan indul ez a reakció? Milyen elemi lépéseken át zajlik a teljes reakció? Vannak elektronikus tényezők, amelyek meghatározzák a reakció termékét, vagy az inkább a szubsztrát pozicionálásán múlik? Az egyes enzimek enzimcsaládra nem jellemző reaktivitásáért, így a PaaABCE esetében a reverzibilitásért, az AurF esetében a négyelektronos oxidációért, az enzim a felelős, a szubsztrát, vagy mindkettő tulajdonságai együtt? A hidrogenáz esetén hogyan működik együtt a hidrogénhasításban a vascentrum a Lewis-savas kofaktorral, és mi eközben az enzimkörnyezet szerepe?

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A metalloenzimek figyelemreméltó kémiai átalakításokat képesek végrehajtani kis reaktivitású molekulákon, enyhe körülmények között. Jelen projektben az elméleti kémiát eszközként alkalmazom olyan új reakcióutak feltárására, amelyek során enzimek O2-t aktiválnak különféle szubsztrátok oxidációjához, vagy H2 aktiválás történik e reagens redukálókészségének kihasználására. A közvetlen eredmények atomi szintű betekintést adhatnak az enzimek által alkalmazott mechanizmusokba, melyeknek köszönhetően ezek a „nehéz” reakciók alacsony gáton át, nagy szelektivitással mennek végbe. A vizsgálni kívánt enzimek aromás vegyületek ingadozó oxigénellátottság melletti lebontásában, bioaktív nitrovegyületek szintézisében, továbbá sejtek anaerob körülmények közötti H2 oxidálás és CO2 redukálás útján történő energiatermelésében játszanak szerepet, így a mechanizmusok vizsgálatával ezekről a kulcsfontosságú biokémiai folyamatokról is többet tudhatunk meg. Az ismert metalloenzim-mechanizmusok spektrumának szélesítése ahhoz is hozzájárul, hogy megértsük ezen enzimek kapcsolait, azaz konkrétan feltárjuk, hogyan jöhettek létre új funkciók korábban „feltalált” szerkezetek apró módosításával, illetve egy-egy biokémiai lépés fontossága hogyan vezetett egymástól független, azonos vagy hasonló reakciót katalizáló enzimek kifejlődéséhez. A projektben vizsgálni kívánt enzimek olyan reakciókban vesznek részt, amelyek szélesebb körben is érdeklődésre tarthatnak számot. A szintetikus kémikusok eszköztárát jócskán lehetne még bővíteni olyan eljárásokkal, melyek O2-t használnak oxidálószernek, H2-t redukálószernek, képesek nem aktivált szénhidrogének kötéseinek szelektív funkcionalizálására, mindezt szobahőmérsékleten és légköri nyomáson, vizes oldatban, olcsó fémekkel. A H2 tiszta energiaforrásként is figyelemreméltó lehet, ha sikerül megoldani egyszerű előállítását, tárolását és felhasználását. Mindezeknek a céloknak a megvalósításához hasznos ötleteket kaphatunk az enzimmechanizmusok megismerése által. A megszerzett tudás hozzájárulhat olyan alkalmazások tervezéséhez is, ahol enzimmimetikus kismolekulák, módosított enzimek, vagy élő sejtek vesznek részt értékes finomkémiai termékek előállításában.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Számos fontos biokémiai reakcióban a Természet olyan enzimeket alkalmaz, amelyek nem csak aminosavakat, hanem fémionokat is tartalmaznak. Ezek az úgynevezett metalloproteinek gyakran fontos szerepet kapnak, amikor az átalakítandó molekula erős kötésekkel, és így csekély reaktivitással rendelkezik. Sok más kémiai reakcióhoz hasonlóan a metalloenzimek által véghezvitt reakciók is több lépésből állnak, azaz több kémiai kötés meghatározott sorrendben szakad fel vagy jön létre, miközben eljutunk a kiindulási anyagtól a termékekig. Ennek a sorrendnek, azaz a reakciómechanizmusnak az ismerete segít megérteni, hogyan és miért képződik a termék, és miért nincsenek a folyamatnak melléktermékei. Ezek az információk nemcsak biokémiai tudásunkat bővítik, hanem ahhoz is hozzájárulhatnak, hogy olcsóbb, tisztább, vagy aktívabb katalizátorokat állítsunk elő széles körben alkalmazott szintetikus folyamatokhoz. A többlépéses reakciók kísérleti vizsgálata nehézségekbe ütközhet, mivel egyes lépések, gyakran pont a legérdekesebbek, nagyon gyorsak lehetnek. A molekuláris szinten történő számítógépes modellezés hasznos kiegészítője lehet a kísérleteknek a reakcióban szereplő elemi lépések feltárásában. Ebben a projektben ilyen számítógépes vizsgálatokat tervezek oxigént és hidrogént hasznosító, fémtartalmú enzimek reakciómechanizmusainak tanulmányozására. A vizsgált enzimek benzolgyűrűt tartalmazó vegyületek (ilyen például a fa anyagának akár harmadát adó lignin) lebontásában, bizonyos antibiotikumok bioszintézisében, illetve az anaerob sejtlégzés egy fajtájában játszanak szerepet.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Metal-containing proteins are usually employed by Nature in “difficult” reactions, such as the activation of dioxygen, dihydrogen, alkane C–C or C–H bonds, or aromatic rings. Many of the involved intermediates are necessarily highly reactive, and therefore not easily amenable to experimental characterization. Theoretical calculations can usefully contribute to mechanistic studies by providing an atomic level description of the observable intermediates as well as revealing the details of the reaction pathways connecting them. The present project aims toward the understanding of bond activation reactions within metalloenzymes using quantum chemical or combined quantum chemical and molecular mechanical calculations on cluster models or whole enzymes. The work will be focused on hitherto unexplored pathways in monoiron or diiron enzymes involved in the activation and utilization of O2 and H2. Specific targets are the O2 activation for substrate epoxidation in the non-heme diiron enzymes benzoyl-CoA epoxidase (BoxAB) and phenylacetyl-CoA epoxidase (PaaABCE) as well as for nitro-forming N-oxygenation in a p-aminobenzoic acid oxygenase (AurF). Unique properties of PaaABCE and AurF, namely the reversibility of the oxygenation reaction and the unusual stoichiometry of substrate oxidation, respectively, will be examined in detail. Furthermore, studies on monoiron hydrogenase are planned to characterize how the iron center and the Lewis acidic cofactor share the task of dihydrogen cleavage within the enzyme environment.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

For the activation of strong covalent bonds, like those in O2, H2, aliphatic or aromatic hydrocarbons, Nature often employs metalloenzymes. Via the fine-tuning of the coordination sphere as well as more distant amino acid residues, very reactive intermediates can be formed within the protein, selectively attacking the target molecules without the danger of harmful side reactions. In the frame of the present proposal, quantum mechanical or combined quantum mechanical and molecular mechanical calculations are planned to provide an atomistic description of the observable and nonobservable intermediates, and to elucidate reaction pathways for metalloenzymes carrying out O2 activation and substrate oxidation, as well as H2 cleavage, with selected examples being BoxAB, PaaABCE, AurF, and [Fe]-hydrogenase. Answers are sought for questions including: What is the nature of the active oxygenated species? What factors cause the metal center plus dioxygen to evolve toward this particular intermediate? What properties make the active species appropriate for the reaction with the natural substrate, and how is the reaction initiated? What are the elementary steps of the whole reaction cycle? Are there electronic factors favoring the specific reaction outcome, or is it merely a substrate positioning issue? For the reactivity untypical for the enzyme class, like reversibility in PaaABCE and a four-electron process in AurF, is the enzyme responsible, or the substrate, or a combination of properties? For the hydrogenase, how do the metal center and the Lewis acidic cofactor cooperate in H2 cleavage, and what key roles can be assigned to the enzyme?

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

Nature’s metalloenzymes can carry out remarkable chemical transformations on molecules with low reactivity under ambient conditions. Using computational chemistry as a tool, the present projects aims toward understanding novel pathways for activation of O2 and its subsequent utilization for oxidative chemistries on diverse substrates, and for activation of H2 to efficiently use the reducing power of this clean reagent. The expected direct results offer an atomistic insight into mechanisms applied by the enzymes to keep the barriers of these “difficult” reactions low and still maintain selectivity. Via the description of these processes, our knowledge will be enhanced on key catalysts in important biochemical pathways since the selected enzymes play a role in the degradation of aromatics under fluctuating O2 conditions, in synthesis of bioactive nitro compounds, or in sustaining life in anaerobic environment via oxidizing H2 and reducing CO2. Extending the known mechanistic spectrum of metalloenzymes may contribute to the understanding of their interconnections, specifically, how new functions have been achieved by minor tuning of already invented structures, and conversely, how the importance of a certain biochemical step could lead to the development of unrelated enzymes catalyzing the same or similar reactions. The transformations carried out by the enzymes to be studied in the present project are also of broader interest. There is still room for improvement of the synthetic chemist’s toolbox with reactions utilizing molecular O2 as oxidant, H2 as reductant, and selective functionalization of unactivated hydrocarbons, all these at room temperature, in water, using cheap metals. H2 is also considered as a clean source of energy, which necessitates its facile production, storage, and utilization. For these purposes, the lessons learned from enzymatic mechanisms can provide new ideas to be realized using artificial systems. Furthermore, the obtained knowledge may contribute to the successful design of enzyme mimics, modified enzymes, or the utilization of whole cells to produce precious fine chemicals.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

For many important biochemical reactions, Nature employs enzymes that contain not only amino acids, but also metal ions. In particular, such metalloproteins often play a role when the molecule to be transformed has strong chemical bonds, and therefore, low reactivity. Just like in many other chemical reactions, metalloprotein-mediated reactions consist of multiple steps, i.e., various bonds are broken and formed in a certain sequence to convert the reactants into the products. The knowledge of this sequence, the reaction mechanism, helps understand the reasons how and why the product forms, and how the formation of side products is avoided. This information, in turn, may contribute not only to a better insight into biochemistry but also to the design or application of cleaner, cheaper, or more active catalysts for widely employed synthetic processes. Experimental characterization of multi-step reactions may pose difficulties as some steps, often the most interesting ones, can be really fast. Computational modeling at the molecular level can usefully complement experiments in the description of the involved elementary steps. In this project, a computational investigation is planned on the reaction mechanisms of metal-containing enzymes utilizing molecular oxygen and hydrogen. The studied enzymes play role in the biodegradation of benzene-ring containing compounds (like lignin, which constitutes up to one third of wood), in the biosynthesis of certain antibiotics, and in a type of anaerobic cellular respiration.





 

Final report

 
Results in Hungarian
A nem-hem divas enzimek egy nagy családot képeznek, és változatos reakciókat, jellemzően dioxigén aktiválását és különféle szubsztrátok oxidatív átalakítását katalizálják. A divas-dioxigén centrum gazdag kémiája nagy kihívást jelent a mechanisztikus tanulmányoknak. Jelen projekt keretében kvantumkémiai számításokat alkalmaztunk lehetséges reakcióutak feltárása és megértése céljából. A delta-9 deszaturáz enzim esetén, mely kettős hidrogénabsztakció révén hoz létre kettős kötést, a sűrűségmátrix renormalizácós csoport módszeren alapuló, nagyléptékű multireferencia ab inito számítások megmutatták, hogy az aktív speciesznek 1,1-mű-hidroperoxi szerkezete van. Ez a metodológia, melyet most először alkalmaztunk bioszervetlen mechanizmusvizsgálatra, a C–H kötéshasítási lépés elektronszerkezetének megbízható leírását adta, ellentétben számos sűrűségfunkcionál-elméleten alapuló módszerrel. A benzoil-koenzim A epoxigenáz enzimben a lehetséges reakcióutak kiterjedt vizsgálata rávilágított, hogy az aromás oxigénezésnek négy lehetséges változata képzelhető el. Ezek a támadás elektrofil vagy gyökös voltában, illetve a résztvevő molekulapályákban különböznek, és jellemzésük fontos hozzájárulás a divas-dioxigén centrum viselkedésének megértéséhez. Végezetül, a projekt során sor került a nem-hem monovas és divas rendszerek számításos kémiai vizsgálataival kapcsolatban egy részletes áttekintő közlemény megírására.
Results in English
Non-heme diiron enzymes form a large family with a broad range of catalyzed reactions, typically involving the activation of dioxygen and selective oxidative transformation of diverse substrates. The rich chemistry of the diiron-dioxygen core presents a significant challenge for mechanistic studies. Within the present project, our focus was to elucidate and understand possible reaction pathways using computational chemistry. For the delta-9 desaturase enzyme, forming a double bond by double hydrogen abstraction, large-scale multireference ab initio calculations using the density matrix renormalization group approach revealed the key active species to have a 1,1-mu-hydroperoxy structure. This methodology, applied here in bioinorganic mechanistic studies at the first time, was shown to provide a reliable description of the electronic structure of the C–H cleavage step, in contrast to several density functional theory methods. For the benzoyl coenzyme A epoxygenase enzyme, an extensive analysis of the possible reaction pathways allowed the characterization of four possible mechanistic scenarios for aromatic oxygenation. Differentiated by the electrophilic or radical character of the attack and by the involved molecular orbitals, these scenarios describe general reactivity features of the diiron-dioxygen core. Finally, a comprehensive review article about the computational aspects of non-heme monoiron and diiron chemistry was prepared.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=108955
Decision
Yes





 

List of publications

 
Rokob TA: Pathways for Arene Oxidation in Non-Heme Diiron Enzymes: Lessons from Computational Studies on Benzoyl Coenzyme A Epoxidase, J AM CHEM SOC 138: (44) 14623-14638, 2016
Chalupsky Jakub, Rokob Tibor Andras, Kurashige Yuki, Yanai Takeshi, Soomon Edward I, Rulisek Lubomir, Srnec Martin: Reactivity of the Binuclear Non-Heme Iron Active Site of Delta(9) Desaturase Studied by Large-Scale Multireference Ab Initio Calculations, J AM CHEM SOC 136: (45) 15977-15991, 2014
Rokob TA, Chalupsky J, Bim D, Andrikopoulos PC, Srnec M, Rulisek L: Mono- and binuclear non-heme iron chemistry from a theoretical perspective, J BIOL INORG CHEM 21: (5-6) 619-644, 2016




Back »