Functional analysis of a mutation in the cattle motilin gene  Page description

Help  Print 
Back »

 

Details of project

 
Identifier
111964
Type PD
Principal investigator Hoffmann, Orsolya Ivett
Title in Hungarian A szarvasmarha motilin gén mutációjának funkcionális vizsgálata
Title in English Functional analysis of a mutation in the cattle motilin gene
Keywords in Hungarian szarvasmarha, genomika, promóter, SNP
Keywords in English bovine, genomics, promoter, SNP
Discipline
Animal breeding (Council of Complex Environmental Sciences)70 %
Ortelius classification: Animal breeding
Genomics, comparative genomics, functional genomics (Council of Medical and Biological Sciences)20 %
Animal biotechnology (Council of Complex Environmental Sciences)10 %
Panel Plant and animal breeding
Department or equivalent Agricultural Biotechnology Institute (ABC) (National Agricultural Research and Innovation Centre)
Starting date 2015-01-01
Closing date 2018-11-30
Funding (in million HUF) 25.315
FTE (full time equivalent) 2.46
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az oltógyomor bal oldali helyzetváltozása (LDA) a tejtermelő tehenészetek állományának 1-7%-át érintő, nagy öröklődhetőségi értékű betegség, amely főleg magas hozamú állatok esetében gyakori. Gyógyítása általában műtéti beavatkozást igényel, így a tehenészetek nyereségességét veszélyezteti.
A betegség pontos genetikai háttere ismeretlen. Több kutatás azt találta, hogy a motilin gén mutációja köthető a betegséghez. A motilin gén promóterében található mutáció (SNP) egy transzkripciós faktor kötőhelyet érint. A betegséggel kapcsolatban megjelent eredmények, azonban genetikai asszociációs vizsgálatokon alapulnak, és nem tartalmazzák a mutáció funkcionális elemzését. Továbbá ezek az asszociációs kutatások DNS szekvencia adatokra támaszkodnak, és nem vizsgálják, hogy az említett SNP befolyásolja-e és ha igen, akkor hogyan a motilin gén expresszióját.
Az első cél tisztázni, hogy a motilin gén mutációja okoz-e expressziós változást. A mutáns és vad típusú promóter riportergén konstrukcióba épített változataival sejttenyészetben, és EMSA módszerrel szeretném vizsgálni a promóteraktivitást.
Mivel a promóterváltozatok vizsgálatának legmegbízhatóbb módszere az in vivo állatmodellen történő tesztelés, így ez a munka második célja. A promóterváltozatok riportergéneket tartalmazó vektorba történő klónozása után transzgénikus egerek hozhatók létre, amelyekben a riportergének expressziója megfelel a promóteraktivitásnak.
A projekt harmadik eleme, hogy új generációs szekvenálás segítségével találjak további olyan genetikai faktorokat, amelyek az LDA betegséghez köthetők. Ehhez egészséges és beteg szarvasmarhákból származó minták teljes transzkriptum szekvenálását tervezem elvégezni.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

Az oltógyomor bal oldali helyzetváltoztatása gyakori betegség szarvasmarhák esetében, ennek ellenére pontos genetikai háttere tisztázatlan. A motilin gén szabályozó régiójában található SNP az egyetlen ismert genetikai tényező, amely köthető a betegséghez. A mutációt ugyan asszociációs vizsgálatok segítségével sikerült a beteg fenotípushoz rendelni, viszont a mutáció funkcionális vizsgálata eddig nem történt meg.
A kutatás során a biotechnológia és a genomika eszközeivel azt szeretném megválaszolni, hogy a motilin gén promóterében elhelyezkedő SNP milyen hatással van a gén expressziójára, illetve, hogy ezen a mutáción kívül vannak-e még más genetikai faktorok, amelyek befolyásolják az LDA betegség kialakulását.
A kísérletekhez beteg és egészséges oltógyomor minták beszerzése szükséges, amelyet a SZIE Állatorvos-tudományi Karának Nagyállatklinikáján dolgozó, a szarvasmarha LDA-ban jártas állatorvos, Dr. Horváth András biztosít számomra.
Elsőként a motilin gén mutáns és vad típusú promóterét szeretném klónozni riportergén konstrukcióba és in vitro szövettenyészetben, valamint EMSA módszerrel vizsgálni. Ezután in vivo állatmodellben vizsgálnám a promóterváltozatok pontos hatását az expressziós mintázatra. Ezek a kísérletek választ adnak arra, hogy a promóterben található SNP-nek van-e valóban reguláló hatása a motilin gén kifejeződésére.
Végül egészséges és beteg szarvasmarha oltógyomor minták teljes transzkriptum szekvenálása segítségével találhatók más, olyan eddig ismeretlen géneket, génváltozatokat, mutációkat, amelyek expressziója változik a betegség során. Így választ kaphatunk arra a kérdésre, hogy köthető-e más genetikai faktor az LDA betegség kialakulásához.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A szarvasmarha oltógyomor bal oldali helyzetváltoztatása (LDA) a tejelő tehenészetekben gyakori probléma. A betegség gyógyítása műtéti úton lehetséges, de ha az állatot sikerül is megmenteni, a gazdának akkor is jelentős bevételkieséssel kell számolnia. Az LDA akár 2-7%-át is érintheti a Holstein-Fríz populációnak, ráadásul a betegség főleg magas hozamú állatok esetében fordul elő.
A betegség kialakulásának hátterében a - tartástechnológiai problémákon kívül – genetikai rendellenesség húzódik. Asszociációs vizsgálatok segítségével sikerült egy mutációt (SNP-t) azonosítani a beteg állatokban, amely a szarvasmarha motilin génjének szabályozó régiójában helyezkedik el. Mivel a mutáció egy transzkripciós faktor kötőhelyet érint, így valószínűleg befolyásolhatja a motilin gén expresszióját, azonban ilyen irányú kutatások hiányoznak a szakirodalomból. A motilin feladata az emésztőszervrendszer mozgásainak finomhangolása, így a gén működésében bekövetkező változás valóban kialakíthatja a betegséget. Az asszociációs vizsgálatokon kívül azonban szükség lenne funkcionális és expressziós vizsgálatokra is, amelyek pontos magyarázatot adhatnak a betegség genetikai hátterére.
Az LDA genetikai hátterének felderítésével képesek lennénk olyan markerek fejlesztésére, amelyek segítségével a betegség visszaszorítható lenne mind hazai, mind nemzetközi viszonylatban.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

A tejelő szarvasmarha állományok gyakori betegsége a bal oldali oltógyomor helyzetváltoztatása. Ez a betegség főleg a jól tejelő, intenzív tartástechnológia mellett tartott Holstein-Fríz állatokat érinti, leginkább az ellést követő hónapokban. Az oltógyomor elváltozása miatt az állat folyadékháztartása felborul, emésztése megváltozik, amelyek következtében az állat lefogyása és jelentős termeléskiesés következik be. A betegség műtéti beavatkozást igényel, amely növeli a telep költségeit. Hazai és nemzetközi viszonylatban is egyre nő az oltógyomor helyzetváltoztatásának következtében kialakult betegségek diagnosztizálásának száma, ez mutatja, hogy szükség van a betegség pontos genetikai hátterének a megértésére.
A kutatás célja, hogy azonosítson olyan genetikai elváltozásokat, amelyek a betegséghez köthetők. Ezeknek az elváltozásoknak a felderítésével képesek leszünk olyan szelekciós programokat kialakítani, amelyek segítségével a betegség kialakulásának lehetősége jelentősen csökkenthető.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

Left displaced Abomasum (LDA) is affecting 1-7% of dairy cattle populations mainly in case of high yield animals. This disease has a high heritability value and its treatment usually requires surgical intervention, thus risking the profitability of dairy farms.
Precise genetic basis of the LDA disease is still unknown. Several studies have found that the motilin gene mutation linked to the disease. This mutation (SNP) is located in a transcription factor binding site at the promoter region of bovine motilin gene. These results based on genetic association studies, and does not include any functional analysis of the mutation. Furthermore, these studies rely on DNA sequence data, and did not examine that those SNP affect and, if so, how the motilin gene expression.
The first aim is to clarify if the mutation of motilin gene cause any change in the gene expression pattern. For this I would like to examine the activity of cloned mutant and wild type promoter with reporter gene construct in cell culture, and in EMSA assay.
The second aim of the proposed project is to create in vivo animal model as this is the most reliable method to test the promoter variations. I would establish transgenic mice strains with reporter gene constructs carrying the mutant and the wild type promoter. The reporter gene expression levels will correspond to the promoter activity.
The third component of the project is to find additional genetic factors tied to the LDA disease with new generation sequencing. For this the whole transcriptome of healthy and diseased cattle will be sequenced.
The proposed work will contribute to the understanding of the genetic background of LDA.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

The left displacement of abomasum (LDA) is a common disease in dairy cattle, despite the precise genetic basis is unclear. The only known genetic factor in connection of LDA is an SNP in the promoter region of the motilin gene. The mutation was connected to the LDA phenotype with association studies, but the functional analysis of the mutation is still missing.
With the methods of biotechnology and genomics the proposed project will investigate on the effect of this SNP to the gene expression pattern. Besides I would like to find other genetic factors that influence the development of LDA disease.
For the experiments samples will be obtained from the abomasum of healthy and diseased animals. Dr. András Horváth (Large Animal Clinic at the Faculty of Veterinary Science, Szent István University) who has experience of LDA disease will kindly provide me these samples.
Firstly, the wild type and the mutant motilin allele will be cloned to reporter construct and will be examined in vitro cell culture. The promoters will also be tested with EMSA method. These methods can service data about the functional mechanisms of the motilin promoter. An in vivo animal model will be developed for the effect of the promoter mutation to the gene expression. These experiments together could offer an answer if the mutation of the promoter has a regulatory effect on the expression of motilin gene.
Secondly, a whole transcriptom analysis of healthy and diseased animals could provide yet unknown genes, gene variations, mutations, which could have change the expression pattern and could effect to the LDA disease. With this experiment we can explore other factors associated to the LDA disease.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

The bovine left displaced abomasum (LDA) is a common problem in dairy cattle. The treatment of the disease is possible surgically, but if one could manage to save the animal, the owner will realize a significant loss of income. The LDA can occur even 1-7% of the Holstein-Fresian population moreover the disease mainly affect the high yield animals.
In addition to housing and foraging technology problems there is a genetic disorder runs. Association studies identified a mutation (SNP) located in the regulatory region of the bovine motilin gene. Since the mutation affects a transcription factor bindig site, thus likely can modify the expression of motilin gene, however functional experiments are missing from the literature. The function of motilin is to fine-tune the movement of digestive system so that any change in the expression of this gene can be the causative mutation and can evolve the LDA. Apart from the association studies a functional analysis of the mutation would be required, which may explain the exact genetic background of LDA disease.
The understanding of the genetic background of LDA would allow us to develop genetic markers which can drive back the disease in Hungarian and international dairy cattle populations.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

Left displaced abomasum (LDA) of cattle is a common disease of the dairy breeds. This disease mainly affects the high yield Holstein-Friesian cattle kept under intensive housing conditions mostly in the month after calving. Because of the displacement of abomasum the animals fluid balance is upset, digestion changes, which result in a significant loss of production and loss of weight. The disease requires a surgical intervention which increases the cost of dairy farm. In the Hungarian and also in the international dairy breeds the occurrence of LDA disease is growing, therefore it is necessity of the correct understanding of the disease.
The aim of the project is to identify genetic changes that are linked to the LDA disease. With the identification of this genetic background we will able to evolve selection programs which can significantly reduce the possibility of developing the disease.





 

Final report

 
Results in Hungarian
Az oltógyomor bal oldali helyzetváltozása a tejtermelő tehenészetek állományának 1-7%-át érintő, nagy öröklődhetőségi értékű betegség, amely főleg magas hozamú állatok esetében gyakori. Gyógyítása általában műtéti beavatkozást igényel, így a tehenészetek nyereségességét veszélyezteti. A motilin gén promóterében található mutáció (SNP) egy transzkripciós faktor kötőhelyet érint és GWAS vizsgálatok alapján köthető a betegséghez. Ennek az mutációnak a funkcionális vizsgálatát célozta a pályázat. A projektben új generációs szekvenálás segítségével vizsgáltuk az oltógyomor transzkriptomában bekövetkező változásokat. Meghatároztuk a különbözően expresszáló géneket, és megállapítottuk, hogy az általunk vizsgált állatokban a motilin jelenléte alacsonyabb volt. A szarvasmarha motilin promóter hosszának vizsgálatához klónoztunk négy egymást átfedő feltételezhető promóter szakaszt és megállapítottuk, hogy ezek közül kettő eredményesen vált ki expressziót. Az egyik így kiválasztott promóter szakaszt tartalmazó CRISPR/Cas9 konstrukcióval megkíséreltünk knock in állatot létrehozni, azonban a knockout sikeressége ellenére homológ rekombinációs esemény nem következett be. Kutatásainkat folytatjuk bevonva a motilin receptort is a vizsgálatainkba, szarvasmarha tápcsatorna szakaszokon vizsgáljuk a motilin és motilin receptor expresszióját, valamint tovább folytatjuk a transzgénikus kísérleteket.
Results in English
The left displacement of abomasum is a disease with high inheritance value affecting 1 to 7% of the dairy herd population, which is common mainly in high yielding animals. Healing usually requires surgical intervention, thus jeopardizing the profitability of dairy farms. The mutation (SNP) in the promoter of motilin gene affects a transcription factor binding site and is linked to the disease by GWAS studies. The application aimed at functional testing of this mutation. In the project, we investigated changes in the transcriptome of the abomasum using next-generation sequencing. We determined the differentially expressed genes and found that motilin was lower in the animals LDA affected aminals. To examine the length of the bovine motilin promoter, four overlapping putative promoter regions were cloned and two were found to elicit the expression. An attempt was made to create a knock in animal using a CRISPR / Cas9 construct containing one of the promoter regions selected, but, despite the success of the knockout, no homologous recombination event occurred. We continue our studies involving the motilin receptor in our studies, investigate the expression of motilin and motilin receptors in bovine gastrointestinal sections, and continue our transgenic experiments.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=111964
Decision
Yes





 

List of publications

 
Tapasztó Attila, Gál Zoltán, Borsy Adrienn, Welker Ervin, Hiripi László, Horváth András, Hoffmann Orsolya Ivett: Genetic analisys of the Left-sided displacement of the abomasum, WG/MC/Scientific Meeting of COST Action BM1308 Sharing Advances on Large Animal Models – SALAAM Poznan, December 13-16, 2015, 2015
Gál Zoltán, Borsy Adrienn, Hiripi László, Horváth András, Hoffmann Orsolya Ivett: Genetic analysis of the left-sided displacement of the abomasum, V. GÖDÖLLŐI ÁLLATTENYÉSZTÉSI TUDOMÁNYOS NAPOK NEMZETKÖZI KONFERENCIA, 2015
Bálint BIRÓ, Zoltán GÁL, Olivér SZABÓ, László HIRIPI, András HORVÁTH, Orsolya Ivett HOFFMANN: INVESTIGATION OF THE GENETIC BACKGROUND OF A COMMON CATTLE DISEASE WITH HRM ASSAY, In: Tamas, L; Zelenyanszki, H (szerk.) Fiatal Biotechnológusok Országos Konferenciája, (2018) pp. 66-66., 2018
Skoda G, Hoffmann OI, Gocza E, Bodrogi L, Kerekes A, Bosze Z, Hiripi L: Placenta-specific gene manipulation in rabbits., JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 259: pp. 86-90., 2017
Z Gál, A Tapasztó, B Biró A Borsy, E Welker, L Hiripi, A Horváth, O I Hoffmann, Z Gál: In vivo examination of an SNP in the bovine motilin gene, , 2017
Z Gál, B Biró, O Szabó, L Hiripi, A Horváth, O I Hoffmann, Z Gál: Identifying the genetic background of a common dairy cattle disease, , 2017
Gál Zoltán, Borsy Adrienn, Hiripi László, Horváth András, Hoffmann Orsolya Ivett, Z Gál: A SZARVASMARHA OLTÓGYOMOR BAL OLDALI HELYZETVÁLTOZÁSÁNAK GENETIKAI VIZSGÁLATA, , 2015
Gál Zoltán, Hiripi László, Horváth András, Hoffmann Orsolya Ivett, Bényi Erzsébet, Pajor Ferenc, Póti Péter, Tőzsér János: A SZARVASMARHA OLTÓGYOMOR BAL OLDALI HELYZETVÁLTOZÁSÁNAK GENETIKAI VIZSGÁLATA, , 2015
Pálinkás Hajnalka, Rácz Gergely, Gál Zoltán, Hoffmann Orsolya, Tihanyi Gergely, Róna Gergely, Gócza Elen, Hiripi László, Vértessy Beáta: CRISPR/Cas9-Mediated Knock-Out of dUTPase in Mice Leads to Early Embryonic Lethality, BIOMOLECULES 9: (4) 136, 2019
Liptak N, Hoffmann OI, Skoda G, Gocza E, Kerekes A, Bosze Z, Hiripi L: Glomerulosclerosis in transgenic rabbits with ubiquitous Venus protein expression., ACTA VETERINARIA HUNGARICA 66: (2) pp. 281-293., 2018
Kerekes A, Hoffmann OI, Iski G, Liptak N, Gocza E, Kues WA, Bosze Z, Hiripi L: Secretion of a recombinant protein without a signal peptide by the exocrine glands of transgenic rabbits., PLOS ONE 12: (10) p. e0187214., 2017
Liptak N, Hoffmann OI, Kerekes A, Iski G, Ernszt D, Kvell K, Hiripi L, Bosze Z: Monitoring of Venus transgenic cell migration during pregnancy in non-transgenic rabbits., TRANSGENIC RES &:, 2017
Schiavo Giuseppina, Hoffmann Orsolya Ivett, Ribani Anisa, Utzeri Valerio Joe, Ghionda Marco Ciro, Bertolini Francesca, Geraci Claudia, Bovo Samuele, Fontanesi Luca: A genomic landscape of mitochondrial DNA insertions in the pig nuclear genome provides evolutionary signatures of interspecies admixture, DNA RESEARCH 24: (5) pp. 487-498., 2017
Tálas András, Péter Istvan Kulcsár, Nóra Weinhardt, Adrienn Borsy, Eszter Tóth, Kornélia Szebényi, Sarah Laura Krausz, Krisztina Huszár, István Vida, Ádám Sturm, Bianka Gordos, Orsolya Ivett Hoffmann, Petra Bencsura, Antal Nyeste, Zoltán Ligeti, Elfrieda Fodor, Ervin Welker: A convenient method to pre-screen candidate guide RNAs for CRISPR/Cas9 gene editing by NHEJ-mediated integration of a 'self-cleaving' GFP-expression plasmid., DNA RESEARCH 24: (6) pp. 609-621., 2017
Hoffmann OI, Kerekes A, Liptak N, Hiripi L, Bodo S, Szaloki G, Klein S, Ivics Z, Kues WA, Bosze Z: Transposon-Based Reporter Marking Provides Functional Evidence for Intercellular Bridges in the Male Germline of Rabbits., PLOS ONE 11: (5) e0154489, 2016




Back »