MicroRNA regulation of TIMP-1 expression in progressive renal fibrosis
Keywords in Hungarian
TIMP-1, miRNS, glomeruloszklerózis, vesefibrózis
Keywords in English
TIMP-1, miRNA, glomerulosclerosis, renal fibrosis
Discipline
Analysis, modelling and simulation of biological systems (Council of Medical and Biological Sciences)
70 %
Nephrology, urology (Council of Medical and Biological Sciences)
30 %
Ortelius classification: Nephrology
Panel
Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent
Institute of Translational Medicine (Semmelweis University)
Starting date
2015-01-01
Closing date
2017-12-31
Funding (in million HUF)
8.940
FTE (full time equivalent)
2.40
state
closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára. A nefrológia legnagyobb kihívása a progresszív vesefibrózis kezelése. A fibrózisban központi szerepe van a transforming growth factor beta-1-nek (TGF-ß) mely fokozza a renális mátrix fehérjék szintézisét. A molekuláris mechanizmus pontos ismerete nélkül is bizonyított, hogy a genetikai háttér meghatározza a progressziót. Diabeteses és hipertenzív nephropathias betegekben a vesefibrózis progressziója betegenként eltérő ütemű, ami bizonyítja a genetikai háttér jelentőségét. Előkísérleteink során megfigyeltük a vesefibrózis törzsfüggő progresszióját TGF-ß transzgenikus egerekben, melyekben genetikai hátterük függvényében eltérő súlyosságú vesefibrózis alakul ki. Igazoltuk, hogy a fibrózis kialakulásában szerepet játszó molekulák közül csak a TIMP-1 mRNS 100-szoros expressziója mutatott szoros összfüggést a CBAxB6-TGF-ß F1 egereket jellemző súlyos fibrózissal összehasonlítva a B6-TGF-ß egerekkel. Primér mesangiális sejteken és UUO modellben is törzsfüggő TIMP-1 választ kaptunk. Előkisérleteink bizonyítják, hogy a genetikai háttér meghatározza a TIMP-1 expressziót és így a vesefibrózis progresszióját. A mikroRNS-ek (miRNS) kis, nem kódoló RNS molekulák melyek a génexpressziót poszt-transzkripciós szinten szabályozzák, és bizonyítottan szerepet játszanak fibrózisban. A TGF-ß és miRNS-ek közötti kölcsönös gátló/serkentő szabályozás révén befolyásolhatják a TGF-ß útvonalat. Ugyanakkor nem ismert a miRNS-ek szerepe a TIMP-1 expresszió szabályozásában. In vitro és in vivo kisérleteink során azonosítjuk a genetikai háttér által meghatározott post-transzkripciós miRNS szintű molekuláris mechanizmust, mely felelős a TIMP-1 expresszió eltérő szabályozásáért vesefibrózisban.
Mi a kutatás alapkérdése? Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek. Hipotézisünk szerint a TIMP-1 expresszió eltérő post-transzkripciós szabályozása magyarázza a vesefibrózis progressziójának törzsfüggő (B6 vs CBA) különbségeit. Vizsgáljuk a különbözö genetikai hátterű TGF-ß transzgenikus egerekben a TIMP-1 neutralizáló antitestek hatékonyságát a vesefibrózis lassítására. Vizsgáljuk, hogy a különböző genetikai hátterű TIMP-1 knockout egerekben eltérő progressziójú vesefibrózis alakul-e ki TGF-ß kezelés hatására. Azonosítjuk azt a post-transzkripciós miRNS szabályozó mechanizmust, amelyik felelős a TIMP-1 expresszió törzsfüggő különbségéért TGF-ß transzgenikus egerekben, UUO modellben és primér mesangiális sejtekben. A legújabb rtípusú miRNS array-vel összehasonlítjuk az eltérő genetikai hátterű TGF-ß transzgenikus egerek renális miRNS expresszióját. Vizsgáljuk az így azonosított miRNS-ek szerepét UUO modellben. Mivel a CBAxB6-TGF-ß F1 transzgenikus egerekben már 5 napos életkorban mesangialis proliferáció alakul ki, in vitro kísérleteinkben az egyes egértörzsekből izolált primer mesangiális sejtekben ellenőrizzük az azonosított miRNS-ek serkentésének (mIRVana) és gátlásának (Anti-mIR) következményeit a TIMP-1 expresszióra.
Mi a kutatás jelentősége? Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának! A végállapotú veseelégtelenség világszerte egyre növekvő egészségügyi problémát jelent. A fejlett országokban folyamatosan emelkedik mind a vesebetegek száma mind pedig a kezelésükre fordított összeg. Ismereteink és terápiás lehetőségeink korlátozottak a különböző etiológiájú vesebetegségek közös végső útját jelentő vesfibrózis kórfolyamatával kapcsolatban. Az esetenként felgyorsult progressziójú vesefibrózis pathomechanizmusának megértése elvezethet új terápiás eljárások kidolgozásához. Különböző genetikai hátterű TGF-ß transzgenikus egerek, TIMP-1 knockout egerek és UUO műtéti modelljén vizsgáljuk, hogy a genetikai háttér és a TIMP-1 expresszió hogyan befolyásolja a vesefibrózis progresszióját. Célunk annak a törzsfüggő post-transzkripcionális miRNS szabályozó mechanizmusnak az azonosítása, amely megmagyarázza a TGF-ß ill. UUO indukálta TIMP-1 expresszióban található különbséget. Eredményeink tükrében a jövőben vizsgálni fogjuk a „gyors” vagy „lassú” progressziót mutató vesebetegekben az általunk felfedezett molekuláris eltérések jelenlétét illetve összefüggését a vesefibrózis progressziójával. A vesefibrózis progresszióját meghatározó molekuláris eltérések, faktorok megismerése lehetővé teszi új terápiás eljárások, kezelések kidolgozását.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára. A végállapotú veseelégtelenség világszerte egyre növekvő egészségügyi problémát jelent. A fejlett országokban folyamatosan emelkedik mind a vesebetegek száma mind pedig a kezelésükre fordított összeg. A helyzetet súlyosbítja, hogy a végállapotú vesebetegség fokozza a kardiovaszkuláris betegségek előfordulását és mortalitását. Még mindig kevés az ismeretünk és a terápiás lehetőségünk a különböző okból kialakuló vesebetegségek közös végső útját jelentő vesfibrózis kórfolyamatával kapcsolatban. Mind diabeteses, mind hipertenzív vesebetegség kapcsán régóta ismert, hogy egyes betegek vesefibrózisa eltérő progressziót mutat. Ezért nagyon fontos megértenünk, hogy mi okozza az esetenként megfigyelhető felgyorsult vesefibrózist. Transzgenikus egérmodellen vizsgáljuk, hogy az eltérő genetikai háttér hogyan befolyásolja a vesefibrózisban kulcsszerepet játszó fehérje hatását a fibrózis progressziójára. Előkísérleteink során megfigyeltük, hogy a kísérleti állatok vesefibrózisának progressziójában található törzsfüggő eltérésekért egy ismert szöveti gátlófehérje eltérő szintje tehető felelőssé. Az állatkisérletek mellett sejttenyészeten végzett kisérletekkel is kutatjuk a genetikai háttér szerepét a fibrózis progressziójában. Új megközelítéssel végzett kisérleteink azonosíthatják a vesefibrózisban kulcsszerepet játszó gátló fehérje szabályozását és lehetővé teszik új terápiás eljárások, kezelések kidolgozását.
Summary
Summary of the research and its aims for experts Describe the major aims of the research for experts. Progressive renal fibrosis is one of the major challenges in nephrology. Transforming growth factor-beta1 (TGF-ß) has a pivotal role in renal fibrosis, inducing the synthesis of extracellular matrix. Several experiments emphasize the importance of genetic differences in the development and progression of renal diseases, yet the molecular mechanism remains unknown. Also, human diabetic or hypertensive nephropathy show different progression rate, suggesting the importance of genetic differences. In our preliminary studies we have observed strain-dependent differences in renal fibrosis progression in TGF-ß transgenic mice, showing markedly different renal phenotypes associated with 100-fold difference in TIMP-1 expression in CBAxB6-TGF-ß F1 kidneys as compared to B6-TGFß mice. We observed strain dependent TIMP-1 expression in primary mesangial cells and in the UUO model of fibrosis as well. Our data demonstrate that genetic background and the progression of TGF-ß induced renal fibrosis strongly associates with altered TIMP-1 mRNA expression level. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA molecules that regulate post-transcriptional gene expression, and they were shown to play a crucial role in organ fibrosis. A regulatory cross-talk exists between TGF-ß and miRNAs, promoting or inhibiting each other’s expression, therefore miRNAs might regulate the TGF-ß pathway in renal fibrosis. However, the role of miRNAs in TIMP-1 expression has not been investigated yet. In the present study we will use both in vitro and in vivo models to elucidate the strain-dependent post-transcriptional miRNA regulation of TIMP-1 expression in renal fibrosis.
What is the major research question? Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments. We hypothesize that post-transcriptional miRNA regulation of TIMP-1 expression is responsible for strain-dependent (B6 vs CBA) differences in the progression of TGF-ß induced renal fibrosis in mice. We will analyze the effect of TIMP-1 neutralization on the progression of renal fibrosis in different TGF-ß transgenic mouse strains. We will also analyze the progression of renal fibrosis in TIMP-1 knockout mice on different strains following the administration of TGF-ß. We will identify the strain-dependent post-transcriptional microRNA (miRNA) regulation of TIMP-1 expression in TGF-ß transgenic mice, UUO model, and primary mesangial cells. Renal miRNA expression differences in TGF-ß transgenic mouse strains (B6 vs CBA) will be confirmed by the latest generation of microRNA array. The strain-dependent expression of identified miRNAs will be studied in the UUO model as well. As fibrosis-prone TGF-ß transgenic mice develop mesangial proliferation as early as at 5 days of age, we will investigate the effects (with mimics, mIRVana) and the inhibition (with Anti-mIR) of identified miRNAs on TIMP-1 expression on primary mesangial cells isolated from both strains.
What is the significance of the research? Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field. End-stage renal disease (ESRD) represents a major and increasing health care problem worldwide. In developed countries, the number of patients and the renal health care costs are continuously increasing. The pathogenesis of renal fibrosis, the final common pathway of chronic renal diseases is still poorly understood and successful therapies are not available. Therefore, investigation of the molecular details of pathomechanism of accelerated renal fibrosis might help to develop better therapeutical strategies in the near future. In our study, we will establish novel animal models to investigate the progression of renal fibrosis influenced by the genetic background and TIMP-1 expression. We will identify the strain-dependent post-transcriptional miRNA regulation of TIMP-1 expression in TGF-ß transgenic mice and verify it in the UUO model of fibrosis and in primary mesangial cells. In the future, we will analyze human kidney samples from “progressor” and “non-progressor” patients to confirm the role of the identified regulatory miRNAs in human renal disease progression. Furthermore, the identification of these regulatory miRNAs might help to develop novel therapeutic approaches against progressive renal fibrosis.
Summary and aims of the research for the public Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others. End-stage renal disease (ESRD) represents a major and increasing health care problem worldwide. In developed countries, the number of patients and the renal health care costs are continuously increasing. ESRD plays a significant role in cardiovascular morbidity and mortality as well. The pathogenesis of renal fibrosis, the final common pathway of chronic renal diseases of different etiologies is still poorly understood and successful therapies are still missing. It is a well known phenomenon that the rate of renal disease progression varies widely among patients with the same disease condition such as diabetic or hypertensive kidney disease. Therefore, it is essential to understand the pathomechanisms of accelerated renal fibrosis. In our experiments we will investigate the influence of genetic background in the molecular mechanisms of renal fibrosis. We will use a novel transgenic mouse model to generate experimental animals with different genetic background. All these transgenic mice express the same profibrotic protein, which promotes the development of renal fibrosis. In our preliminary experiments we have observed a strain-dependent elevation of a particular inhibitor that might be responsible for accelerated fibrosis. We also plan to investigate the effect of genetic susceptibility on the expression of fibrotic proteins in cell culture system. Our experiments provide a unique approach to elucidate the role of genetic background in the progression of renal fibrosis and might help to develop better therapeutical strategies in the near future.
Final report
Results in Hungarian
Vesefibrózisban szenvedő betegekben a betegség progressziója betegenként eltérő ütemű, feltehetően a genetikai különbségek miatt. Emellett beltenyésztett egereken végzett korábbi kísérletek is bizonyították a vesefibrózisra való eltérő érzékenységet. Kísérleteinkben először bizonyítottuk, hogy egerekben a vesefibrózis iránti genetikai érzékenység összefügg a szöveti metalloproteáz inhibítor-1 (TIMP-1) túltermelésével. Ezt bizonyítottuk eltérő genetikai hátterű egerekben TGF-ß transzgenikus, unilaterális uréter obstrukció és veseabláció modellekben egyaránt. Ezen kívül, hasonló eredményt kaptunk primér mezangiális sejtkultúrákon végzett kísérleteinkben is. A molekuláris biológiai vizsgálataink alapján az AP-1, EGR-1 és EGR-2 transzkripciós faktorok szorosan korrelálnak a fibrózis progresszióval, mely részben összefüggést mutatott a miR-199 és miR-200 mikroRNS-ek expressziójával is. In vitro kísérleteinkben alapján a miR-200 képes csökkenteni mind az EGR-2, mind a TIMP-1 termelését. Kimutattuk továbbá, hogy a vese medullában krónikus hiperozmolaritás hatására fokozódik az AP-1 és EGR-1 expresszió mind in vitro, mind in vivo, mely ronthatja egy meglévő vesebetegség progresszióját. Bizonyítottuk továbbá, hogy diabéteszben szoros összefüggés van a vese TIMP-1 termelése és az NO-cGMP tengely csökkent működése között (részben az alacsonyabb szolubilis guanilát cikláz aktivitás révén).
Results in English
Renal fibrosis patients show different progression rates, presumably due to genetic invariances, and earlier reports showed that inbred mouse strains also have different susceptibility to renal fibrosis. In our studies, we have first showed that genetic susceptibility to renal fibrosis in mice is associated with tissue inhibitor of metalloprotease-1 (TIMP-1) overexpression. This was confirmed using TGF-ß transgenic mice, unilateral ureter obstruction (UUO) and renal ablation (SNX) models on mice with different genetic backgrounds. Moreover, we obtained similar results using primary mesangial cell cultures. Our molecular analysis revealed that the transcription factors AP-1, EGR-1 and EGR-2 correlate with fibrosis progression, partly associated with upregulation of microRNAs miR-199 and miR-200. We also showed that miR-200 can reduce both EGR-2 and TIMP-1 response in vitro. We have also found that chronic hyperosmolarity upregulates AP-1 and EGR-1 in the renal medulla both in vivo and in vitro, which might worsen an ongoing kidney disease. In addition, we also demonstrated an interaction between renal TIMP-1 and the impaired NO-cGMP axis (with low soluble guanylyl cyclase activity) in diabetes.
Gábor Kökény, Ágnes Németh, Jeffrey B. Kopp, László Rosivall, Miklós M. Mózes: Genetic susceptibility to renal fibrosis in mice is associated with TIMP-1, (manuscript in preparation), 2018
Kokeny G, Nemeth A, Szabo L, Fazekas K, Rosivall L, Mozes M: Subtotal renal ablation induces tubulointerstitial EGR-2 overexpression in mce, NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION 30:(Supplement: 3) Paper FP307. (2015), 2015
Kokeny G, Nemeth A, Fazekas K, Szenasi G, Rosivall L, Mozes MM: MicroRNA networks in the progression of TGF-beta induced renal fibrosis, NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION 31:(Suppl.1.) p. 1422. 1 p., 2016
Mozes MM, Nemeth A, Szabo L, Fazekas K, Kokeny G: Early and sustained RUNX1 activation after unilateral ureter obstruction in mice: a possible new player in renal fibrosis, NEPHROLOGY DIALYSIS TRANSPLANTATION 31:(Suppl.1.) p. 1438. 1 p., 2016
