Identification and characterisation of novel targets of the evolutionarily conserved Protein phosphatase 4  Page description

Help  Print 
Back »

 

Details of project

 
Identifier
115404
Type PD
Principal investigator Lipinszki, Zoltán
Title in Hungarian Az evolúciósan konzervált Fehérje Foszfatáz 4 új célpontjainak azonosítása és jellemzése
Title in English Identification and characterisation of novel targets of the evolutionarily conserved Protein phosphatase 4
Keywords in Hungarian Fehérje foszfatáz 4, centroméra, sejtosztódás szabályozása, fehérje-fehérje kölcsönhatás, Drosophila, sejtbiológia, szerkezeti biológia
Keywords in English Protein Phosphatase 4, centromere, cell cycle regulation, protein-protein interaction, Drosophila, cell biology, structural biology
Discipline
Molecular biology (Council of Medical and Biological Sciences)80 %
Ortelius classification: Molecular biology
Molecular genetics, reverse genetics and RNAi (Council of Medical and Biological Sciences)10 %
Ortelius classification: Molecular genetics
Cell cycle and division (Council of Medical and Biological Sciences)10 %
Panel Cellular and Developmental Biology
Department or equivalent Institute of Biochemistry (Biological Research Centre Szeged)
Starting date 2015-10-01
Closing date 2018-03-31
Funding (in million HUF) 20.915
FTE (full time equivalent) 2.40
state closed project
Summary in Hungarian
A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.

Az Eukarióta sejtosztódás precíz szabályozásának feltétele az ellentétes hatású fehérje kinázok és foszfatázok (PP) által katalizált foszforilációs-defoszforilációs mintázatok összehangoltsága. A sejtciklus működésének megértéséhez ezért nélkülözhetetlen a PP funkciójának megfejtése, amely egyike a mitózis-kutatás még fennmaradt kihívásainak. A Fehérje Foszfatáz 4 (PP4) holoenzim egy létfontosságú Ser/Thr-típusú PP, amely részt vesz a sejtosztódás szabályozásában, bár ennek mechanizmusa még nem teljesen ismert. A PP4-en végzett kutatásaink az enzim újfajta mitótikus szerepét tárták fel. Ecetmuslicában kimutattuk, hogy a holoenzim R3 alegységének (Falafel) konzervált EVH1 doménje révén közvetlenül kapcsolódik egy kulcsfontosságú centomérikus fehérjéhez, a CENP-C-hez. A CENP-C-hez kötődő PP4 aktivitása pedig nélkülözhetetlen a centroméra/kinetokór hálózat sértetlenségének fenntartásában, amely előfeltétele a hibátlan kromoszóma szétválásnak. A Falafel EVH1 doménjének és a kölcsönható CENP-C fehérje szakasz kristályszerkezetének vizsgálatával rámutatottunk a PP4 újfajta szubsztrátum-felismerő mechanizmusára is, amely feltehetően konzerválódott az evolúció folyamán. A tervezett molekuláris és sejtbiológiai kísérletekkel bizonyítani szeretném, hogy a PP4 ezen szubsztrátum-felismerő mechanizmusa a sejtosztódás szabályozásában résztvevő más fehérjék esetében is hasonlóan működik, ezért azonosítani szeretnék új mitótikus PP4 szubsztrátumokat és meghatározni azok PP4-kötő konszenzus szekvenciáját ecetmuslicában. Emellett szeretném továbbvizsgálni a PP4-függő CENP-C foszforeguláció szerepét a centroméra/kinetokór integritásának fenntartásában.

Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.

A tervezett kutatási projekt alapkérdései:
i. Melyek a PP4 sejtciklus szabályozásában szerepet játszó szubsztrátumai ecetmuslicában és milyen mechanizmussal kötődik az enzim ezekhez a fehérjékhez? A mitótikus foszfatáz-kutatások egyik alapproblémája, hogy nem rendelkezünk holoenzim-specifikus gátlószerekkel és a kevés kivételtől eltekintve nem ismerjük a foszfatázok konszenzus motívumát a célfehérjéken. Egyre több bizonyítékunk van arra vonatkozóan, hogy a különböző fajokban található PP4 holoenzim R3 alegységének konzerválódott EVH1 doménje felelős a célfehérjék, így szubsztrátumok felismeréséért (pl. Falafel-EVH1/CENP-C muslicában). Továbbá, az R3 alegység ortológjainak EVH1-szerű doménje különbözik a más fehérjékben fellelhető kanonikus EVH1 doménektől, így másfajta ligandumokhoz is kötődik. Ezért szeretnénk azonosítani újabb PP4 célfehérjéket/szubsztrátumokat muslicában, mert így a tervezett kísérletekkel megfejthetnénk azok PP4-felismerési szekvenciáját, ami lehetővé tenné PP4-kötő konszenzus motívumok azonosítását. Ennek pedig komoly gyakorlati haszna lenne: a) megjósolhatnánk a PP4 lehetséges szubsztrátumait különféle fajokban is; b). alap vagy alkalmazott kutatási célokra alkalmas PP4-specifikus gátlószereket fejleszthetnénk.
ii. Milyen módon vesz részt a PP4 a centroméra/kinetokór integritásának szabályozásában? A centroméra/kinetokór épsége az egyik alapfeltétele a genomi stabilitásnak, ezért a tervezett kísérletek arra a fontos alapkérdésre adhatnak választ, hogy a PP4 a CENP-C defoszforilációja révén, vagy a centromérához kapcsolódva fizikai jelenlétével segíti a normális sejtosztódás végbemenetelét.

Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!

A PP4 olyan fontos sejtélettani folyamatokban vesz részt, mint a DNS hibajavítás, sejtciklus szabályozás, apoptózis, sejt proliferáció és migráció. Nélkülözhetetlen a sejt túléléséhez, de paradox módon szerepe van az apoptótikus folyamatok indukálásában is. A PP4 és egyéb foszfatázok hibás működése számos proliferatív betegség kialakulását elősegítik, ezért mint potenciális anti-tumor célpontokat tartják őket számon. A PP4 túltermelődése például kimutatható a hasnyálmirigy, tüdő és mellrák bizonyos típusaiban, de a PP4c katalitikus alegység konzerválódott aminosavainak mutációját is több daganatos elváltozás esetében leírták. Ez utóbbi az enzim megváltozott aktivitását okozhatja, de a holoenzim összeszerelődésére, így a szubsztrátum-felismerésre is hatással lehet. Kísérleteink hozzájárulhatnak a PP4 működésének pontosabb megértéséhez, amely nélkülözhetetlen e komplex működésű enzim manipulációjához. A tervezett kísérletek eredményei kétségtelenül új lehetőségeket nyitnak meg jövőbeni alapkutatásokhoz is:
i. A PP4 eddig ismeretlen, centromérához köthető szerepének mélyebb megismerése új kérdéseket vet majd fel.
ii. Új, sejtciklus-függő PP4 szubsztrátumok (és foszforilációs helyek) azonosításával lehetőségünk lesz megvizsgálni ezen fehérjék foszforegulációjának biológiai hatását és azonosítani a kinázt, amely a módosítást végzi.
iii. A módszert alkalmazhatjuk egyéb típusú (pl. DNS hibajavítás, apoptózis, stb.) PP4 szubsztrátumok (majd különféle PP4-kötő motívumok) azonosítására megfelelően kezelt sejtvonalak vagy beteg szövetek felhasználásával, akár más fajokban is.
iv. Többféle típusú vagy affinitású PP4-kötő motívum meghatározásával lehetőség nyílhat: a). inhibitor molekulák kifejlesztésére, amelyek a legtöbb vagy csak bizonyos szubsztrátum-csoportok PP4-hez történő dokkolását gátolják; b). új PP4 szubsztrátumok azonosítására bioinformatikai módszerekkel.
iv. Habár a PP4 leggyakrabban PP4c-R2-R3 konfigurációban fordul elő, az irodalom beszámol olyan holoenzimekről is, melyekben a PP4c más típusú alegységekkel alkot komplexumot. Eredményeink alapján az várható, hogy a kidolgozott módszerek könnyedén alkalmazhatók lesznek egyéb regulátor alegységek interakciós partnereinek meghatározására is.

A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média illetve az adófizetők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI számára.

Életünk folyamán a sejtjeink osztódnak, ez elengedhetetlen feltétele a növekedésünknek, vagy az utódainkat létrehozó ivarsejtjeink kialakulásának. A sejtosztódás lebonyolításában részt vevő fehérjék gyakran egy különleges módosításon, ún. foszforiláción mennek keresztül, melyet fehérje kinázok katalizálnak, míg az eltávolításukban az ellentétes hatású fehérje foszfatázok vesznek részt. A foszforiláció jelenléte vagy hiánya, mint egyfajta molekuláris kapcsoló képes meghatározni a módosított fehérje szerepét, vagy, hogy milyen más fehérjékkel lépjen kapcsolatba. Tehát a fehérje kinázok és foszfatázok rendkívül fontos szerepet töltenek be a sejtosztódás finom-szabályozásában, ezért nem meglepő hogy számos rákos megbetegedésben mutatták ki hibás működésüket.
A kutatásaink célpontja a Fehérje Foszfatáz 4 (PP4), egy szegényesen jellemzett enzim, melynek ugyanakkor fontos szerepet tulajdonítanak a sejtosztódás szabályozásában. Biokémiai és sejtbiológiai kísérleteink célja a PP4 által módosított fehérjék azonosítása, megérteni hogyan kapcsolódik az enzim a fehérjékhez és miként hat ez a sejtosztódás folyamataira. A kísérletek elvégzését egy jól jellemzett, olcsón fenntartható modellorganizmusban, az ecetmuslicában tervezzük, amelynek PP4 enzime rendkívül hasonló az emberéhez. A projekt eredményei alapján képesek lehetünk fajlagos PP4 gátlószerek tervezésére, amelyre nagy szükségünk lehet annak tudatában, hogy a PP4 túlozott működését már különféle rákos elváltozásokban is kimutatták.
Summary
Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.

The precise regulation of Eukaryotic cell division requires the tight coupling of protein phosphorylation and dephosphorylation events driven by the antagonistic actions of protein kinases and protein phosphatases (PPs). To fully understand cell cycle progression, it is necessary to analyze the function of the PPs, which is still a major challenge in mitosis research. Protein Phosphatase 4 (PP4) is an essential Ser/Thr-type PP that has been identified as important regulator of the cell cycle, although its role in these processes is poorly known. Our resent work has revealed a novel mitotic function of PP4. We found that the conserved EVH1 domain of the R3 subunit of Drosophila PP4, Falafel, directly binds to the key centromeric protein CENP-C. This interaction brings PP4 activity to CENP-C ensuring the maintenance of centromere/kinetochore integrity, a prerequisite for accurate chromosome segregation. Interestingly, the crystal structure of the Falafel EVH1 domain bound to a CENP-C peptide, revealed a new target-recognition mode for PP4, which is likely to be conserved in evolution. In this research project I will attempt to prove that PP4 exploits this new target-recognition mechanism in the binding of other cell cycle regulated proteins using biochemical and cell biological techniques. For this purpose I plan to identify and characterize novel mitotic substrates of PP4 and determine their PP4-binding consensus motifs. In parallel, I aim to further dissect the role of PP4 in CENP-C phosphoregulation and its requirement in maintaining centromere/kinetochore integrity.

What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.

There are two objectives of the proposed project:
i. Which are the cell cycle-related substrates of PP4 in Drosophila and what is the binding mechanism that ensures the substrate recognition of the enzyme? A basic problem in the field of mitotic phosphatase research is that we do not have holoenzyme-specific inhibitors and, apart from a few exceptions we do not know the phosphatase-binding consensus motifs of the targeted proteins. Emerging evidence suggests, however, that the conserved EVH1 domain of R3 subunits of the PP4 is responsible for substrate recognition in various species (e.g. Falafel-EVH1/CENP-C in flies). Moreover, the EVH1-like domains of R3 orthologues vary from the canonical EVH1 domains common in different proteins, suggesting they bind to atypical EVH1 ligands. With the planned experiments we aim to identify new PP4 targets/substrates in Drosophila, which will allow us to find their PP4-binding sequences and finally, to determine PP4-binding consensus motifs. Having such motifs would let us: a). the prediction of PP4 targets/substrates also in other species; b). the development of PP4-specific inhibitors either for basic or applied research purposes.
ii. How PP4 is involved in the regulation of centromere/kinetochore integrity? The structural integrity of the centromere/kinetochore network is essential to maintain genomic stability; therefore the proposed research would answer whether the physical presence of PP4 at the centromere or CENP-C’s dephosphorylation by PP4 is needed to regulate centromere/kinetochore biology.

What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.

PP4 is involved in essential cellular processes, such as DNA checkpoint and repair, cell cycle progression, apoptosis, cell proliferation and migration. Paradoxically, its activity is needed for cell survival as well as the induction of apoptosis. The dysfunction of PP4 and other phosphatases promotes the formation several proliferative diseases, therefore they are considered to be potential anti-tumour targets. In fact, PP4’s overexpression has been associated with certain types of pancreatic, lung and breast cancers, moreover, the mutations of conserved amino acid in the catalytic subunit of PP4 has been identified in different tumours. The latter may cause increased or decreased activity of PP4, or affect the assembly of the holoenzyme, thus the substrate recognition of PP4. Our research may contribute to the better understanding of PP4’s function, a prerequisite for the manipulation of this enzyme complex. Moreover, our results will certainly open new avenues for future basic research:
i. More detailed analysis of the so far unknown centromeric role of PP4 will raise new questions of the field.
ii. The identification of new cell cycle substrates (and their phosphorylation sites) of PP4 would let us to investigate the biological relevance of the proteins’ phosphoregulation and perhaps the identification the opposing kinase.
iii. Our method can be applied to identify new groups of PP4 substrates (e.g. from DNA repair, apoptosis, etc) and PP4-binding motifs from drug-treated cell cultures of malignant tissues, also from other species.
iv. Determination of distinct PP4-bindig consensus motifs would allow us to: a) develop general inhibitors or more specialised ones, which inhibit only certain groups of PP4 substrates; b) predict PP4 substrates using bioinformatics.
v. Although PP4 usually acts a heterotrimeric complex of PP4c-R2-R3, the literature reveals evidence that PP4c can form mutually exclusive complexes with other ancillary or regulatory proteins. Our method can easily be applied to identify interacting partners of such regulators of PP4c.

Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NKFI in order to inform decision-makers, media, and the taxpayers.

During our life cells are dividing, which is the prerequisite for growing or production of gametes, the cells needed for reproduction. Proteins orchestrating cell division are often regulated by a special modification, called phosphorylation, which is catalysed by protein kinases and removed by the opposing activity-bearing protein phosphatases. The presence or absence of phosphorylation acts as a molecular switch, which can determine the specific role or the interacting partners of the modified protein. Consequently, protein kinases and phosphatase have essential roles in fine-tuning the progression through cell division, and not surprisingly, the dysregulation of these enzymes has been shown in several human malignancies, including cancer.
The target of the proposed research is Protein phosphatase 4 (PP4), a poorly characterised enzyme, which, however, is considered as an essential regulator of cell division. Our aims are to identify proteins dephosphorylated by PP4 using biochemical and cell biological approaches, to define the mechanism PP4 uses to bind these proteins and to understand how these events regulate cell division. We propose to perform experiment in fruit flies, a well established model organism that has two additional advantages: cheap and its PP4 enzyme is very similar to that of the human counterpart. Since PP4’s dysfunction has been linked to certain types of cancer, there is a need for PP4-specific inhibitors. Our results may provide important data for the development of such inhibitors.





 

Final report

 
Results in Hungarian
Kutatásink során azonosítottuk az evolúciósan konzervált PP4 fehérje foszfatáz enzim közel 60 lehetséges mitótikus partnerét ecetmuslica modellben, melyek többsége fehérje komplexum. Részletes in vitro fehérje-kölcsönhatási kísérletekben 10 olyan fehérjét sikerült kiválogatnunk, melyek tényleges fizikai kölcsönhatásba lépnek a PP4 receptor alegységével, a Falafellel. További vizsgálatokkal lokalizáltuk a Falafel EVH1 és SMK-1 doménjeivel kölcsönható fehérjékben található interakciós helyeket, melyek részletesebb analízise jelenleg is folyik. Ennek célja, hogy azonosíthassunk PP4 konszenzus kötő-motívumokat, melyek ismeretében a PP4-et specifikusan gátolhatjuk, vagy további PP4 szubsztrátumokat kereshetünk bioinformatikai módszerekkel. A fenti eredményekből kiindulva molekuláris kapcsolatot találtunk a PP4 és számos mitótikus esemény között, úgy mint az orsó-összeszerelődést ellenőrző mechanizmus, kromoszóma szétválás, centroszóma érés vagy centromére integritás szabályozása. Eredményeink segítik annak megértését, hogy hogyan vesz részt a létfontosságú PP4 enzim a sejtosztódás szabályozásának finomhangolásában.
Results in English
We have identified circa 60 putative interacting partners, mostly protein complexes, of the evolutionarily conserved PP4 phosphatase in fruit flies. Detailed analyses of these candidates by performing in vitro binding assay have revealed 10 proteins that physically interact with the EVH1 or SMK-1 domains of Falafel, the substrate recognizing regulatory 3 subunit pf PP4. Narrowing-down experiments have led us to roughly localize putative Falafel-interacting motifs within these proteins, whose further dissection is still under progress. It is important to identify consensus PP4-binding motifs in order to be able to specifically inhibit PP4 function or to search for additional PP4 substrates via bioinformatics. Our results revealed molecular connections between PP4 activity and different mitotic events, such as chromosome separation, spindle assembly checkpoint regulation, centrosome maturation or centromere integrity to help us better understanding how this essential enzyme contribute to cell cycle progression.
Full text https://www.otka-palyazat.hu/download.php?type=zarobeszamolo&projektid=115404
Decision
Yes





 

List of publications

 
Lipinszki Zoltán: Reconstitution of the Drosophila Protein Phosphatase 4 holoenzyme, Biokémia folyóirat (2016/9, 35. oldal)/ Biokémia journal (2016/9, page 35), 2016
Lipinszki Zoltán: Reconstitution of the Drosophila Protein Phosphatase 4 holoenzyme, Biokémia folyóirat (2016/9, 35. oldal)/ Biokémia journal (2016/9, page 35), 2016
Kármán Zoltán. Nagy Zsuzsánna és Lipinszki Zoltán: FOSZFORILÁLNI VAGY DEFOSZFORILÁLNI: AZ ITT A KÉRDÉS!, Biokémia (XLI./2., page 30.), 2017
Haracska Lajos, Lipinszki Zoltán és Udvardy Andor: A 26S PROTEASZÓMA POLIUBIKVITIN RECEPTOR ALEGYSÉGÉNEK KALANDOS AZONOSÍTÁSA, Biokémia (XLI/2., page 64.), 2017
Margit Pál, Zsuzsánna Nagy, Andor Udvardy and Zoltán Lipinszki: STABILON: a short conserved motif that prevents proteins from degradation, EMBO Junior European Drosophila Investigators (JEDI) meeting, Porto Conte, Sardinia, Italy, 2017
Zoltan Lipinszki: Mitotic functions of the evolutionarily conserved Protein Phosphatase 4, EMBO Europhosphatase Conference, Paris, France, 2017
Zoltán Lipinszki, Margit Pál and Andor Udvardy: Novel function of the evolutionarily conserved terminal lysine cluster of p54, the polyubuiquitin receptor subunit of the 26S proteasome, Straub Days conference, BRC, Szeged, Hungary, 2017
Zoltán Lipinszki, Margit Pál, Hardeep Kaur and Andor Udvardy: FUNCTION OF THE TERMINAL LYSINE CLUSTER OF P54, THE POLYUBUIQUITIN RECEPTOR SUBUNIT OF THE 26S PROTEASOME, Hungarian Molecular Life Sciences conference, Eger, Hungary, 2017
Zsuzsanna Györfy, Zoltán Lipinszki, Tóbiás Sári, Frederick R. Blattner, György Pósfai: ENHANCING THE TRANSLATIONAL CAPACITY OF AN E. COLI CHASSIS BY MANIPULATION OF THE GENOMIC COPY NUMBER OF RRNA AND TRNA GENES, Hungarian Molecular Life Sciences conference, Eger, Hungary, 2017
Ágota Nagy, Zoltán Lipinszki, Levente Kovács, Margit Pál, Péter Deák: DEVELOPMENTAL STAGE- AND TISSUE-SPECIFIC UBIQUITIN LEVELS IN DROSOPHILA MELANOGASTER, Hungarian Molecular Life Sciences conference, Eger, Hungary, 2017
Dzhindzhev NS, Tzolovsky G, Lipinszki Z, Abdelaziz M, Debski J, Dadlez M, Glover DM: Two-step phosphorylation of Ana2 by Plk4 is required for the sequential loading of Ana2 and Sas6 to initiate procentriole formation, OPEN BIOL 7: (12), 2017
Áron Szabó, Christian Papin1, Davi Cornu, Elisabeth Chélot, Zoltán Lipinszki, Andor Udvardy, Virginie Redeker, Ugo Mayor, François Rouyer: Ubiquitylation dynamics of the clock cell proteome and TIMELESS during a circadian cycle, Cell Reports (közlésre elfogadva 2018.04.14.), 2018




Back »