 |
Development of new fluorogenic dyes for super-resolution microscopy of site-specifically engineered proteins
|
Help 
Print 
|
Here you can view and search the projects funded by NKFI since 2004
Back »
|
| |
Details of project |
|
|
| Identifier |
116265 |
| Type |
NN |
| Principal investigator |
Kele, Péter |
| Title in Hungarian |
Új fluorogén festékek fejlesztése genetikailag módosított fehérjék szuperfelbontású mikroszkópiával történő vizsgálatához |
| Title in English |
Development of new fluorogenic dyes for super-resolution microscopy of site-specifically engineered proteins |
| Keywords in Hungarian |
fluorogén, bioortogonális, nem természetes aminosav, szuper-felbontású mikroszkópia |
| Keywords in English |
fluorogenic, bioorthogonal, non-canonical amino acid, super-resolution microscopy |
| Discipline |
| Organic, Biomolecular, and Pharmaceutical Chemistry (Council of Physical Sciences) | 80 % | | Ortelius classification: Intelligent materials | | Organic, Biomolecular, and Pharmaceutical Chemistry (Council of Physical Sciences) | 20 % |
|
| Panel |
Chemistry 2 |
| Department or equivalent |
Institute of Organic Chemistry (Research Center of Natural Sciences) |
| Participants |
Kormos, Attila
London-Kozma, Eszter Erika
|
| Starting date |
2015-09-01 |
| Closing date |
2018-08-31 |
| Funding (in million HUF) |
30.000 |
| FTE (full time equivalent) |
6.75 |
| state |
closed project |
Summary in Hungarian A kutatás összefoglalója, célkitűzései szakemberek számára
Itt írja le a kutatás fő célkitűzéseit a témában jártas szakember számára.
A szuperfelbontású mikroszkópia fejlődésével mára lehetővé vált biomolekuláris folyamatok rutinszerű követése a 100 nm alatti mérettartományban is. A legújabb műszaki fejlesztéseknek köszönhetően mára leginkább a specifikus jelölést lehetővé tevő megfelelő fluoreszcens festékek hiánya az a tényező, ami leginkább korlátozza a felbontóképesség további növelését. A biológiai alkalmazások szempontjából e korlátok a fluorofórok stabilitására, méretére, fotofizikai tulajdonságaira, biokompatibilitására és nem-invazív, helyspecifikus jelölést lehetővé tevő reaktivitására vonatkoznak. A helyspecifikus jelzés kis szintetikus vegyületekkel úgy oldható meg, ha bioortogonális funkciós csoporttal rendelkező, nem-természetes aminosavval módosítjuk a célfehérjét, majd ezen keresztül visszük be a komplementer funkcióval rendelkező fluoreszcens jelzővegyületet. E pályázat célja olyan fluorogén jelzővegyületek előállítása, melyek kiváló jel-zaj arány elérését és ezzel együtt a felbontóképesség további növelését teszik lehetővé. Két csoport, azid és tetrazin egységet tartalmazó származékok szintézisét tűztük ki célul. E vegyületekben az azid/tetrazin egység egyrészről a bioortogonális funkciós csoport szerepét, másrészről a fluoreszcenciát kioltó (fluorogén) tulajdonságért is felel. A pályázat leginnovatív részeként olyan vegyületek előállítását is tervezzük, melyekben két bioortogonális csoport is szerepel. Ez utóbbi vegyületcsoporttól kiemelkedően magas fluorogenitást és specifitást remélünk. A szuperfelbontású mikroszkópia felbontóképességének növelésével, egyéb fluoreszcens technikákkal kiegészítve, (pl. FRET) lehetőség nyílik biomolekuláris folyamatok mélyebb szintű megértésére.
Mi a kutatás alapkérdése?
Ebben a részben írja le röviden, hogy mi a kutatás segítségével megválaszolni kívánt probléma, mi a kutatás kiinduló hipotézise, milyen kérdéseket válaszolnak meg a kísérletek.
Kutatási tervünk kiinduló hipotézise, hogy az azid és tetrazin motívumok által egyidejűleg megvalósítható bioortogonális és fluorogén tulajdonságok kombinációja új, helyspecifikus jelzést lehetővé tevő fluorogén jelzővegyületek előállítását eredményezi. Olyan fluorogén vegyületek szintézisét tervezzük, melyek, genetikailag kódolt nem-természetes aminosavakkal együtt alkalmazva lehetőséget teremtenek a szuperfelbontású mikroszkópiában jelenleg meglevő akadályok legyőzésére. A fluorogének tervezésekor egyrészt a szuperfelbontású mikroszkópiában már bizonyítottan alkalmazható vázak, másrészt új aromás rendszerek módosításából indulunk ki. A fluorogén tulajdonság vizsgálatán kívül a jelzővegyületek polaritását is változtatjuk, mivel célunk membrán-permeábilis azid- és tetrazinszármazékok előállítása. A fotofizikai tulajdonságokat tekintve fontos szempont az is, hogy a fluoreszcencia „bekapcsolása” után a gerjesztési és emissziós hullámhosszak az in vivo alkalmazhatóság szempontjából előnyösebb vörös-távoli vörös, közeli infravörös tartományba essenek. A tervezett vegyületek egy speciális csoportját képezik az ún. kétszeresen-fluorogén vegyületek. E molekulákban két azid vagy tetrazin egység található és reményeink szerint azon kívül, hogy magas fokú specifitással képesek reagálni megfelelően tervezett, kétszeresen bioortogonalizált fehérjékkel, nagyobb mértékű fluorogenitással is lesznek jellemezhetők. A szintéziseket követően, az alapszintű fotofizikai, membrán-permeabilitás, stabilitás vizsgálatokon kívül, korszerű fotofizikai mérésekkel kívánjuk meghatározni a vegyületek különféle SRM technikákban, valamint in vivo jelölési eljárásokban való alkalmazhatóságát.
Mi a kutatás jelentősége?
Röviden írja le, milyen új perspektívát nyitnak az alapkutatásban az elért eredmények, milyen társadalmi hasznosíthatóságnak teremtik meg a tudományos alapját. Mutassa be, hogy a megpályázott kutatási területen lévő hazai és a nemzetközi versenytársaihoz képest melyek az egyediségei és erősségei a pályázatának!
A pályázatban megfogalmazott tervek nagyobb ívű célokat is tartalmaznak, mint amilyen a kétszeresen-fluorogén vegyületek előállítása. E nehezebben elérhető, de nagyon ígéretes célok mellett egyszerűbben előállítható vegyületek szintézisét és szuperfelbontású mikroszkópiás alkalmazásának fixált sejteken történő vizsgálatát is célul tűztük ki. Azzal együtt, hogy a jelzővegyületek in vivo alkalmazhatósága az elsődleges cél, még a fixált sejtes körülmények közt közepesen teljesítő vegyületek is hasznos eredményeket szolgáltatnak a további tervezés szempontjából. Arról nem is szólva, hogy e festékek kiválóan alkalmazhatók pl. izolált fehérjék FRET technológiákkal történő vizsgálata során. A fluorogén vegyületek nagy előnye, hogy alkalmazásuk nem igényel idő- és energiaigényes tisztítási lépéseket, ezért még azok a jelzővegyületek is, melyek nem felelnek meg az SRM feltételeknek hasznosak lehetnek a biomolekuláris folyamatok megértésére irányuló különféle képalkotó technikákkal való kutatások során. A tervben foglalt szintetikus és kémiai-biológiai feladatok elegendő eredménnyel szolgálnak ahhoz, hogy a projekt időtartama alatt 2-3 doktori és ugyanennyi alap vagy mesterképzésben részt vevő hallgató munkájának képezzék az alapját. Fontos megemlíteni azt is, hogy külön figyelmet szentelünk annak, hogy az együttműködő laboratóriumok közötti kölcsönös látogatások alkalmával a résztvevő diákok betekintést nyerhessenek a másik fél munkájába. Ezáltal a projektre teljesebb rálátással rendelkeznek és megtanulják, milyen lehetőségek állnak a rendelkezésükre és milyen korlátok adódhatnak egy adott kutatómunka elvégzése során. Ezek fényében a kutatás egyrészt oktatási célokat is szolgál, másrészt a molekuláris biológiai folyamatok jobb megértéséből fakadóan az orvosi diagnosztikában, és gyógyszerkutatásban is hasznosítható eredményekkel kecsegtet.
A kutatás összefoglalója, célkitűzései laikusok számára
Ebben a fejezetben írja le a kutatás fő célkitűzéseit alapműveltséggel rendelkező laikusok számára. Ez az összefoglaló a döntéshozók, a média, illetve az érdeklődők tájékoztatása szempontjából különösen fontos az NKFI Hivatal számára.
A tavalyi évben Nobel-díjjal elismert, mikroszkópokkal kapcsolatos fejlesztések mára lehetővé teszik a biomolekuláris folyamatok rutinszerű vizsgálatát a nanométeres tartományban. Ezek az úgynevezett szuperfelbontású mikroszkópos technikák fluoreszcens jelzővegyületek által kibocsátott fény észlelésén alapulnak. Bár a készülékek fizikai paraméterei lehetővé tennék a felbontóképesség további növelését, megfelelő stabilitással, fluoreszcens paraméterekkel rendelkező, biokompatibilis és speciális kémiai kapcsolódást lehetővé tevő jelzővegyületek híján erre nincs lehetőség. Ahhoz, hogy a vizsgálható mérettartomány a molekulák méretének megfelelő léptékűvé váljon, olyan jelzővegyületekre van szükség, melyek megfelelnek a fenti kitételeknek. Mindenképpen olyan kémiai átalakításokat kell alkalmaznunk a jelzés bevitele során, melyek biokompatibilisek, gyorsak, szelektívek. A bioortogonális kémiai átalakítások megfelelnek ezeknek az elvárásoknak, géntechnológiai módszerekkel kombinálva lehetőséget nyújtanak az élő rendszerek fluoreszcens jelzővegyületekkel való szelektív módosítására anélkül, hogy annak működését, életképességét befolyásolnák. E pályázatban olyan jelzővegyületek előállítását tűztük ki célul, melyek összetett tulajdonságaiknak köszönhetően egyrészt bioortogonális jelzésre alkalmasak, másrészt az ún. fluorogén – azaz csak a kémiai módosítást követően fényt kibocsátó – tulajdonságuknak következtében lehetőséget nyújtanak a felbontóképesség további növelésére. E jelzővegyületek hozzájárulhatnak az élő rendszerek működésének jobb megértéséhez, ezáltal döntő jelentőséggel bírnak az orvosi diagnosztikában, és gyógyszerkutatásban.
| Summary Summary of the research and its aims for experts
Describe the major aims of the research for experts.
Super-resolution microscopy based sub-diffraction techniques can now be routinely used to study biomolecular processes at resolutions below 100 nm. Due to recent advances in fluorescence hardware developments, the current unavailability of dyes suitable for site-specific labelling of proteins inside living cells can nowadays be considered as the biggest limitation in SRM techniques. Major limitations for SRM in biology are now rather the quality, size, photophysical properties, biocompatibility and non-invasive site-specific installation of fluorophores. To reach the ultimate goal of further increasing resolution to match the typical size of biomolecules novel dyes must be developed. As most synthetic dyes cannot be directly genetically encoded, site-specific labelling of proteins becomes possible through genetic encoding of non-canonical amino acids (ncAA) bearing bioorthogonal functionalities that can react with dyes harboring complementary functions. Herein we propose the synthesis of novel fluorogenic dyes, which provide improved signal-to-noise ratios. Two fluorogenic scaffolds are proposed: i) azide and ii) tetrazine bearing fluorescent units, where the azide/tetrazine is the bioorthogonally reactive moiety and quencher of fluorescence at the same time. Furthermore, we aim to achieve extraordinary high fluorogenicity and specificity by exploring innovative double quenching strategies. SRM aided by multiple labeling with such fluorogenic dyes can be extended to e.g. energy transfer systems offering excellent combination of imaging tools for the better understanding of biological processes.
What is the major research question?
Describe here briefly the problem to be solved by the research, the starting hypothesis, and the questions addressed by the experiments.
Our hypothesis is that the two-in-one combination of bioorthogonality and quenching effect of the azide and tetrazine functions can be exploited when designing biorthogonally applicable fluorogenic probes for super-resolution microscopy applications. We propose that such fluorogenic frameworks in combination with genetically manipulated proteins can be the means to overcome the recent limitations in SRM technology. In the design process we rely on the use of dye-frameworks that are proven to be applicable in SRM techniques. Furthermore, we design new, fluorogenic frameworks as well. The polarity of proposed structures is also varied in order to get a better picture on membrane-permeability of the probes. We shall design membrane permeable, yet hydrophilic azide and tetrazine based fluorogenic systems with red, far-red and near infra-red emission characteristics, i.e., features that are most advantageous in in vivo imaging techniques. A special group of proposed structures is represented by double-quenched scaffolds. These frameworks contain two biorthogonally applicable quencher groups (azide or tetrazine) that can react with specifically designed genetically encoded tags bearing two complementary functions. Our hypothesis is that such quenched systems have high and specific affinity towards target-tags and have multiple enhancement factors thus resulting in higher enhancement values. Besides basic characterization (spectral, fluorogenicity, membrane permeability, stability), all newly synthetized dyes are to be further characterized for advanced photophysical characteristics for suitability in SRM imaging and specificity for in vivo imaging studies.
What is the significance of the research?
Describe the new perspectives opened by the results achieved, including the scientific basics of potential societal applications. Please describe the unique strengths of your proposal in comparison to your domestic and international competitors in the given field.
The more challenging tasks e.g. the synthesis and performance of double-quenched systems together with double-site amber suppression technology certainly hold out a promise for excellent methodological improvements. However, while the above goals are really challenging and a positive outcome is not guaranteed, several more straightforward objectives will also be met. In particular, we will examine the performance of all dyes in SRM imaging of fixed cells, which is a very powerful technology. While live cell technologies are preferred, even those dyes that only perform well under fixed conditions will depict a great advance. Furthermore, in solution, single-molecule FRET is a very powerful tool to measure distances and dynamics of purified proteins. Even dyes that do not behave well with cells, could be suitable for labeling proteins for subsequent smFRET studies. The use of fluorogenic probes exerts an advantage as cumbersome purification procedures can be avoided. Thus, even new dyes, that are seemingly not the “ideal”-“dream” dye, might have a large impact on very important applications as well and consequently on the understanding of biomolecular processes.
Throughout the grant period this project can serve enough synthetic, semi-synthetic, chemical biology and molecular biology / imaging results for more PhDs, (2-3) and undergraduates who are to be involved in this project. Furthermore, we do aim to extensively permit the students to mutually visit the two labs so that they receive exposure and training in all aspects relevant to this project. This exchange if facilitated by our belief that besides the specialization on the given topic during the course of a PhD, it is important to learn about the possibilities and limitations of all aspects involved in achieving the ultimate goal of generating optimal fluorescent probes and superresolution results. Consequently, such developments enable substantial progress in medical diagnostics and drug development.
Summary and aims of the research for the public
Describe here the major aims of the research for an audience with average background information. This summary is especially important for NRDI Office in order to inform decision-makers, media, and others.
Latest, Nobel-prize winning innovations in microscopy technology enabled routine nanoscale observation of biomolecular processes. These so-called super-resolution microscopy (SRM) applications utilize fluorescent dyes that stain the area of interest. Although recent hardware developments could offer even better resolution for the exploration of living matter, the unavailability of suitable fluorescent dyes limits further improvements. Major limitations for SRM in biology are the quality, size, light-emitting features, biocompatibility and non-invasive specific installation of such dyes. To reach the ultimate goal of further increasing resolution to match the typical size of biomolecules novel dyes must be developed. It is also crucial how these fluorescent labels are implemented into the biomolecule of interest. Bioorthogonal reactions offer biocompatible and selective means to manipulate proteins with light emitting dyes. In combination with genetic engineering even site selective modulation of proteins is possible. In this project we aim at exploring the possibility to create new light emitting (fluorescent) dyes that have complex features. They bear a bioorthogonal function, which enables selective reaction with target proteins and quench the fluorescence of the dye molecule. When reacting with the protein of interest, however, this quenching effect is ceased therefore light emission is reinstated. Such turn-on dyes are highly demanded to improve resolution of lens-based microscopy methods. Development of new dyes might have a large impact on SRM applications and on the understanding of biomolecular processes, consequently on medical diagnostics and drug development.
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
List of publications |
|
|
| Demeter Orsolya, Kormos Attila, Koehler Christine, Mezõ Gábor, Németh Krisztina, Kozma Eszter, Takacs Levente, Lemke Edward A, Kele Peter: Bisazide Cyanine Dyes as Fluorogenic Probes for Bis-cyclooctynylated Peptide Tags and as Fluorogenic Crosslinkers of Cyclooctynylated Proteins, BIOCONJUGATE CHEM 28: (5) pp. 1552-1559., 2017 | | Demeter O, Fodor E A, Kállay M, Mező G, Németh K, Szabó P T, Kele P: A Double-Clicking Bis-Azide Fluorogenic Dye for Bioorthogonal Self-Labeling Peptide Tags, CHEM-EUR J 22: 6382-6388, 2016 | | Knorr G, Kozma E, Herner A, Lemke EA, Kele P: New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes, CHEM-EUR J 22: 8972-8979, 2016 | | Kozma E, Nikić I, Varga B R, Aramburu I V, Kang J H, Fackler O T, Lemke E A, Kele P: Hydrophilic trans-Cyclooctenylated Non-Canonical Amino Acids for Fast Intracellular Protein Labeling, CHEMBIOCHEM 17: 1518-1524, 2016 | | Söveges B, Imre T, Szende T, Póti Á L, Cserép G B, Hegedűs T, Kele P, Németh K: Systematic study of protein labeling by fluorogenic probes using cysteine targeting vinyl sulfone-cyclooctyne tags, ORG BIOMOL CHEM 14: 6071-6078, 2016 | | Demeter Orsolya, Kormos Attila, Koehler Christine, Mezõ Gábor, Németh Krisztina, Kozma Eszter, Takacs Levente, Lemke Edward A, Kele Peter: Bisazide Cyanine Dyes as Fluorogenic Probes for Bis-cyclooctynylated Peptide Tags and as Fluorogenic Crosslinkers of Cyclooctynylated Proteins, BIOCONJUGATE CHEM in press: , 2017 | | Kozma E, Demeter O, Kele P: Bio-orthogonal Fluorescent Labelling of Biopolymers through Inverse-Electron-Demand Diels–Alder Reactions, CHEMBIOCHEM 18: 486-501, 2017 | | Kozma E, Estrada Girona G, Paci G, Lemke E A, Kele P: Bioorthogonal Double-Fluorogenic Siliconrhodamine Probes for Intracellular Superresolution Microscopy, CHEM COMMUN 53: 6696-6699, 2017 | | Knorr G, Kozma E, Schaart J M, Németh K, Török Gy, Kele P: Bioorthogonally applicable fluorogenic cyanine-tetrazines for no-wash super-resolution imaging, BIOCONJUGATE CHEM 29: pp. 1312-1318., 2018 | | Kormos A, Koehler C, Fodor A E, Rutkai Zs R, Martin M E, Mező G, Lemke E A, Kele P: Bistetrazine-Cyanines as Double-Clicking Fluorogenic Two-Point Binder or Crosslinker Probes, CHEM-EUR J 24: (35) pp. 8841-8847., 2018 | | Kozma E, Paci G, Estrada Girona G, Lemke E A, Kele P: Fluorogenic Tetrazine-Siliconrhodamine Probe for the Labeling of Noncanonical Amino Acid Tagged Proteins, METHODS MOL BIOL 1728: pp. 337-363., 2018 | | Petrovics R, Soveges B, Egyed A, Knorr G, Kormos A, Imre T, Torok G, Zeke A, Kocsmar E, Lotz G, Kele P, Nemeth K: A rapid and concise setup for the fast screening of FRET pairs using bioorthogonalized fluorescent dyes, ORG BIOMOL CHEM 16: (16) pp. 2997-3005., 2018 | | Pünkösti Z, Kele P, Herner A: Synthesis of 7-azido-3-formylcoumarin – a key precursor in bioorthogonally applicable fluorogenic dye synthesis, J HETEROCYCLIC CHEM 55: pp. 1183-1188., 2018 | | Söveges B, Imre T, Póti Á L, Sok P, Kele Zs, Alexa A, Kele P, Németh K: Tracking down protein-protein interaction via FRET-system using site-specific thiol-labeling, ORG BIOMOL CHEM 16: Paper 10.1039/C8OB00742J. , 2018 | | Demeter Orsolya, Kormos Attila, Koehler Christine, Mezõ Gábor, Németh Krisztina, Kozma Eszter, Takacs Levente, Lemke Edward A, Kele Peter: Bisazide Cyanine Dyes as Fluorogenic Probes for Bis-cyclooctynylated Peptide Tags and as Fluorogenic Crosslinkers of Cyclooctynylated Proteins, BIOCONJUGATE CHEM 28: (5) pp. 1552-1559., 2017 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
